本文關(guān)鍵詞：共翻譯分子伴侶RAC與80S核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)研究

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【摘要】：核糖體是具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的蛋白核酸復(fù)合物,在生物體內(nèi)的主要功能是進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯。當(dāng)新生肽鏈從核糖體上翻譯生成時(shí),容易發(fā)生聚集以及錯(cuò)誤的折疊。生物體內(nèi)進(jìn)化出了一系列與核糖體相結(jié)合的共翻譯分子伴侶來對新生肽鏈進(jìn)行及時(shí)的保護(hù)和初步的折疊。在真核生物中,主要的共翻譯分子伴侶有NAC和RAC/SSB系統(tǒng)。在RAC/SSB系統(tǒng)中,Hsp40蛋白Zuotin和Hsp70蛋白Ssz能形成穩(wěn)定的二元復(fù)合物RAC,RAC能夠通過Zuotin與核糖體相結(jié)合。Zuotin的Jdomian結(jié)構(gòu)域能夠特異性的刺激Hsp70蛋白Ssb的ATP酶活性,促使Ssb將ATP水解為ADP。ADP狀態(tài)下的Ssb能夠緊密的結(jié)合新生肽鏈,發(fā)揮共翻譯分子伴侶的功能。更為重要的是,越來越多的證據(jù)表明共翻譯分子伴侶能夠?qū)颂求w的翻譯起到調(diào)控作用。到目前為止RAC/SSB系統(tǒng)在核糖體上發(fā)揮功能的具體機(jī)制尚不明確。我們在大腸桿菌中過量表達(dá)并分離純化得到了RAC和Zuotin蛋白。通過蔗糖密度梯度離心的方法分離得到了酵母80S核糖體。在Titan Krios和F20冷凍透射電鏡下收集了大量數(shù)據(jù),通過多輪三維分類和三維重構(gòu)最終解析了高分辨率的RAC?80S核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)。RAC與80S核糖體的大小亞基都有結(jié)合。RAC在大亞基上與L31,L22,H59和H101相結(jié)合,在小亞基上與ES12相結(jié)合。在溶液中,核糖體兩個(gè)亞基之間能夠自發(fā)的旋轉(zhuǎn),RAC能與不同旋轉(zhuǎn)狀態(tài)下的80S核糖體相結(jié)合。Zuotin的中間結(jié)構(gòu)域MD是由一根含有大量帶電氨基酸的α螺旋所構(gòu)成。RAC與核糖體大小亞基的結(jié)合主要是通過Zuotin MD的α螺旋以靜電相互作用的方式介導(dǎo)。MD在RAC與核糖體之間起到了雙向信息傳遞的作用:一方面小亞基發(fā)生旋轉(zhuǎn)的構(gòu)象變化信息能夠通過MD傳遞到Zuotin N端,使J-domain更加靠近肽鏈出口位置,有助于發(fā)揮共翻譯分子伴侶的功能。另一方面,MD能夠通過抑制小亞基的旋轉(zhuǎn),來降低核糖體的翻譯速率。翻譯速率的降低有助于共翻譯分子伴侶對新生肽鏈進(jìn)行及時(shí)的保護(hù)。通過酵母生長實(shí)驗(yàn)我們證明MD的帶電性、剛性以及最適長度對酵母的正常生長是必需的。我們的結(jié)構(gòu)研究不僅揭示了RAC在核糖體上的空間定位,還闡釋了共翻譯分子伴侶RAC對核糖體翻譯的調(diào)控機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：共翻譯分子伴侶 核糖體 冷凍電鏡 RAC Ssb
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q75
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 第1章 引言10-34
• 1.1 真核生物核糖體的組成和結(jié)構(gòu)10-15
• 1.1.1 核糖體高分辨結(jié)構(gòu)的研究歷史10-12
• 1.1.2 真核生物核糖體的結(jié)構(gòu)特征12-15
• 1.2 真核生物蛋白質(zhì)的翻譯過程15-17
• 1.3 新生肽鏈需要共翻譯分子伴侶的折疊和保護(hù)17-26
• 1.3.1 蛋白質(zhì)的折疊17-21
• 1.3.2 原核生物的共翻譯分子伴侶TF21
• 1.3.3 真核生物的共翻譯分子伴侶NAC21-22
• 1.3.4 真核生物的共翻譯分子伴侶RAC22-25
• 1.3.5 RAC與核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)的研究25-26
• 1.4 冷凍電鏡背景介紹26-31
• 1.4.1 電子輻照損傷和低信噪比27-28
• 1.4.2 中心截面定理28-29
• 1.4.3 單顆粒三維重構(gòu)29
• 1.4.4 電鏡結(jié)構(gòu)的驗(yàn)證和評估29-31
• 1.5 本課題的研究意義31-34
• 第2章 材料與方法34-66
• 2.1 實(shí)驗(yàn)儀器34-35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)緩沖液35-36
• 2.3 蛋白的表達(dá)純化36-44
• 2.3.1 載體的構(gòu)建36-39
• 2.3.2 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)39-40
• 2.3.3 蛋白質(zhì)的純化40-44
• 2.4 釀酒酵母核糖體的分離純化44-47
• 2.4.1 釀酒酵母總核糖體的粗提44-45
• 2.4.2 釀酒酵母 80S核糖體的分離45-47
• 2.5 冷凍樣品的制備47-52
• 2.5.1 銅網(wǎng)的預(yù)處理47-48
• 2.5.2 碳膜的噴鍍和撈取48-50
• 2.5.3 冷凍樣品的制備流程50-52
• 2.6 冷凍樣品的數(shù)據(jù)收集52-59
• 2.6.1 冷凍上樣52-54
• 2.6.2 電鏡狀態(tài)的調(diào)節(jié)54-57
• 2.6.3 數(shù)據(jù)的手動(dòng)收集57-58
• 2.6.4 高通量自動(dòng)化數(shù)據(jù)收集58-59
• 2.7 冷凍樣品的數(shù)據(jù)處理59-66
• 2.7.1 圖片的預(yù)處理60
• 2.7.2 計(jì)算欠焦值60-62
• 2.7.3 圖片的篩選62-63
• 2.7.4 顆粒的自動(dòng)挖取63-64
• 2.7.5 對顆粒的二維分類64
• 2.7.6 對顆粒的三維分類64-65
• 2.7.7 三維重構(gòu)迭代、振幅校正和分辨率評估65-66
• 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析66-113
• 3.1 蛋白質(zhì)的純化結(jié)果66-68
• 3.2 核糖體的提取純化結(jié)果68-70
• 3.3 在數(shù)據(jù)收集和處理過程中的一些創(chuàng)新性思路70-76
• 3.3.1 冷凍樣品儲(chǔ)存盒的改良70-71
• 3.3.2 一種挑選square的方式71-72
• 3.3.3 對圖片的實(shí)時(shí)監(jiān)測和運(yùn)算72-73
• 3.3.4 一種篩選顆粒的方法73-74
• 3.3.5 一種對star文件中的顆粒進(jìn)行分組的方法74-75
• 3.3.6 基于Relion的supervised classification75-76
• 3.4 RAC與 80S核糖體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)及分析76-111
• 3.4.1 RAC與 80S核糖體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征76-77
• 3.4.2 RAC與 80S核糖體復(fù)合物高分辨結(jié)構(gòu)的獲取77-87
• 3.4.3 RAC在 80S核糖體上的結(jié)合位點(diǎn)87-89
• 3.4.4 Zuotin與Ssz在空間上的定位89-91
• 3.4.5 Zuotin通過MD與核糖體相結(jié)合的分子機(jī)制91-95
• 3.4.6 RAC的結(jié)合與ES27的構(gòu)象無關(guān)95-97
• 3.4.7 核糖體的旋轉(zhuǎn)能引起Zuotin N端發(fā)生構(gòu)象變化97-99
• 3.4.8 Zuotin的結(jié)合能抑制核糖體的旋轉(zhuǎn)99-106
• 3.4.9 MD是核糖體和RAC之間的雙向信息傳遞者106
• 3.4.10 MD的帶電性、剛性和長度在進(jìn)化上非常保守106-108
• 3.4.11 MD的帶電性、剛性和長度在功能上是必需的108-111
• 3.5 RAC/SSB系統(tǒng)的工作機(jī)制111-112
• 3.6 本章小結(jié)112-113
• 第4章 討論與展望113-120
• 4.1 RAC可能會(huì)對核糖體解碼中心產(chǎn)生影響113-114
• 4.2 RAC可能介導(dǎo)了蛋白質(zhì)翻譯與折疊的同步性114
• 4.3 共翻譯因子在核糖體上的競爭關(guān)系114-116
• 4.4 直接電子探測器的應(yīng)用可能有助于RAC的局部分類116-118
• 4.5 分辨率的追求與生物學(xué)問題的解決118-120
• 第5章 其它研究工作120-128
• 5.1 核糖體小亞基成熟因子YqeH的結(jié)構(gòu)研究120-122
• 5.2 機(jī)械力敏感離子通道Ynai的結(jié)構(gòu)研究122-124
• 5.3 炎癥小體適配蛋白PYD結(jié)構(gòu)域的螺旋結(jié)構(gòu)研究124-126
• 5.4 分枝桿菌核糖體的結(jié)構(gòu)研究126-128
• 參考文獻(xiàn)128-141
• 致謝141-144
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果144

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本文編號(hào)：697028