本文關(guān)鍵詞：人源PHF6 extended PHD2結(jié)構(gòu)域以及PHF6與RBBP4相互作用的結(jié)構(gòu)與功能研究

  更多相關(guān)文章： PHF6 BFLS疾病 extended PHD T-ALL NuRD復合物 RBBP4 轉(zhuǎn)錄抑制

【摘要】：人源PHF6(PHD finger protein6)基因,位于X染色體q26-q27區(qū),是目前己知的唯一發(fā)現(xiàn)與Borjeson-Forssman-Lehmann Syndrome (BFLS)遺傳疾病相關(guān)的基因。另外PHF6基因還被發(fā)現(xiàn)在急性T淋巴細胞白血病病人或急性髓細胞白血病病人中存在多種形式的突變,使得PHF6蛋白喪失活性。PHF6蛋白被發(fā)現(xiàn)與PAF1復合物關(guān)聯(lián)并調(diào)控大腦皮層神經(jīng)元的遷移,這可能與人的智力形成有關(guān)。PHF6蛋白還被發(fā)現(xiàn)在細胞核質(zhì)中與NuRD復合物相互作用,但具體功能并不清楚。另有研究表明PHF6蛋白在核仁中通過與UBF1相互作用調(diào)控細胞周期和rRNA的合成。PHF6在生物體發(fā)育過程中起著非常重要的作用,與人的智力障礙疾病以及血液疾病等相關(guān),但目前對PHF6蛋白的具體細胞功能和致病機理研究較少,結(jié)構(gòu)方面研究沒有報道。 PHF6蛋白含有兩個不標準的PHD (plant homeodomain)結(jié)構(gòu)域和四個核定位信號(NLS)。我們利用晶體學方法成功解析了PHF6的第二個extended PHD結(jié)構(gòu)域(ePHD2),這是第一次該類型結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)報道,該結(jié)構(gòu)域比以前報道的PHD結(jié)構(gòu)域在N端延伸了將近七十個氨基酸(稱為：pre-PHD),該extended PHD2結(jié)構(gòu)域同時螯合三個鋅原子。Pre-PHD與PHD結(jié)構(gòu)域間由一段長α螺旋和一段長的loop連接,它們存在廣泛的相互作用,共同折疊成一個整體。我們用核磁弛豫實驗研究了該結(jié)構(gòu)域的動力學特征,并用RDC實驗證明pre-PHD和PHD2是一個整體。PHD結(jié)構(gòu)域一般識別組蛋白尾巴,不幸地是我們沒有找到PHF6的extended PHD2結(jié)合組蛋白的有力證據(jù),而我們通過凝膠遷移,熒光偏振和核磁滴定實驗發(fā)現(xiàn)extended PHD2能夠結(jié)合雙鏈DNA,但沒有序列特異性。另外我們發(fā)現(xiàn)PHF6蛋白能通過其包含核仁定位信號序列的區(qū)域與NuRD復合物的RBBP4/RbAp48組分直接相互作用,通過該相互作用PHF6蛋白能介導基因的轉(zhuǎn)錄抑制。 我們接著在前期工作的基礎(chǔ)上利用ITC實驗測量了PHF6小肽與RBBP4蛋白間的解離常數(shù),并解析了二者的高分辨率復合物晶體結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)顯示PHF6小肽結(jié)合在RBBP4偏小上表面的酸性裂縫中,PHF6小肽的一對堿性氨基酸的側(cè)鏈插入到RBBP4的負電口袋中,而這對堿性氨基酸對PHF6與RBBP4間的相互作用的重要性用體外ITC實驗和體內(nèi)免疫共沉淀實驗都得到證明。結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn)RBBP4結(jié)合PHF6小肽的口袋與其識別FOGl小肽和組蛋白H3的位置是一致的,但與其識別組蛋白H4, Su(z)12和MTA1小肽是分離的、不同的,說明RBBP4能夠作為一個支架蛋白,通過自身結(jié)構(gòu)的不同位置結(jié)合不同的蛋白,從而行使相關(guān)的功能。PHF6中的RBBP4識別motif在陸生脊椎動物中是高度保守的。我們發(fā)現(xiàn)PHF6的中間無序結(jié)構(gòu)區(qū)域(145-207aa)就足以介導GAL4報告基因的轉(zhuǎn)錄抑制,而敲低RBBP4基因能夠削弱PHF6蛋白介導的轉(zhuǎn)錄抑制。我們的研究在結(jié)構(gòu)水平上確定了PHF6與NuRD復合物間的直接關(guān)聯(lián),也暗示PHF6在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)和基因調(diào)控方面起著一定的作用,但其具體的生物學功能和調(diào)控機制還需要進一步研究和探索。
【關(guān)鍵詞】：PHF6 BFLS疾病 extended PHD T-ALL NuRD復合物 RBBP4 轉(zhuǎn)錄抑制
【學位授予單位】：中國科學技術(shù)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R394
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第1章 緒論13-29
• 1.1 研究背景13-29
• 1.1.1 PHF6與Borjeson-Forssman-Lehmann綜合征(BFLS)疾病,T細胞急性淋巴細胞白血病(T-ALL)和急性髓細胞白血病(AML)13-19
• 1.1.1.1 PHF6與Borjeson-Forssman-Lehmann綜合征疾病13-18
• 1.1.1.2 PHF6與急性白血病18-19
• 1.1.2 Mi-2/NuRD(Nucleosome Remodeling and Deacetylation)復合物19-26
• 1.1.3 PHF6與Mi-2/NuRD復合物的相互作用26-28
• 1.1.4 PHF6與核糖體RNA(rRNA)的生物合成28-29
• 第2章 實驗材料與方法29-65
• 2.1 人源PHF6和RBBP4/RbAp48的克隆29-45
• 2.1.1 蛋白質(zhì)邊界選擇29
• 2.1.2 目的蛋白基因的擴增29-31
• 2.1.3 目的基因片段核酸電泳31-32
• 2.1.4 目的基因片段的膠回收32-33
• 2.1.5 質(zhì)粒DNA的抽提33-34
• 2.1.6 基因片段、載體質(zhì)粒的雙酶切與回收34-36
• 2.1.7 酶切片段與載體連接36
• 2.1.8 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備36-37
• 2.1.9 連接產(chǎn)物或質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞37-38
• 2.1.10 菌落PCR鑒定與測序38-39
• 2.1.11 突變體的構(gòu)建39-40
• 2.1.12 RBBP4重組Bacmid的構(gòu)建40-41
• 2.1.13 RBBP4重組Bacmid的鑒定與提取41-42
• 2.1.14 High Five~(TM)昆蟲細胞(BT1-Tn-581-4 Insect cells)的復蘇培養(yǎng)和凍存42-43
• 2.1.15 重組桿狀病毒的獲得43-45
• 2.2 PHF6和RBBP4/RbAp48蛋白的表達與粗純化45-48
• 2.2.1 PHF6蛋白的表達與粗純化45-47
• 2.2.2 RBBP4/RbAp48蛋白的表達與粗純化47-48
• 2.3 SDS-PAGE電泳48-50
• 2.4 分子篩與離子交換50-51
• 2.5 蛋白質(zhì)濃度的測定51
• 2.6 相互作用實驗51-55
• 2.6.1 GST pull down實驗51-52
• 2.6.2 凝膠遷移實驗(EMSA)52-53
• 2.6.3 熒光偏振實驗(FPA)53-54
• 2.6.4 Western blotting54-55
• 2.6.5 ITC實驗55
• 2.7 核磁實驗55-60
• 2.7.1 同位素標記PHF6 ePHD2結(jié)構(gòu)域56
• 2.7.2 標記樣品記核磁譜56
• 2.7.3 標記樣品的凍干重溶56
• 2.7.4 核磁譜圖處理與化學位移指認56-58
• 2.7.5 核磁共振約束指認(NOE和二面角約束)58
• 2.7.6 主鏈弛豫常數(shù)的測定58-59
• 2.7.7 RDC定向介質(zhì)的制備59-60
• 2.8 蛋白結(jié)晶,數(shù)據(jù)收集與結(jié)構(gòu)解析60-61
• 2.8.1 蛋白質(zhì)的結(jié)晶60
• 2.8.2 晶體衍射數(shù)據(jù)收集、處理與結(jié)構(gòu)解析60-61
• 2.9 哺乳細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染61-62
• 2.10 免疫共沉淀(co-IP)62-63
• 2.11 shRNA敲低(knockdown)基因63-65
• 第3章 PHF6蛋白extended PHD2結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)功能研究65-93
• 3.1 實驗結(jié)果65-87
• 3.1.1 PHF6蛋白extended PHD結(jié)構(gòu)域邊界的選擇65
• 3.1.2 PHF6蛋白的克隆,表達,純化65-71
• 3.1.3 PHF6 ePHD2結(jié)構(gòu)域的主鏈動力學分析71
• 3.1.4 PHF6 extended PHD2結(jié)構(gòu)域與組蛋白的相互作用71-72
• 3.1.5 PHF6 extended PHD2結(jié)構(gòu)域的晶體生長,數(shù)據(jù)收集與結(jié)構(gòu)解析72-75
• 3.1.6 PHF6 extended PHD2結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)75
• 3.1.7 PHF6 extended PHD2結(jié)構(gòu)域折疊成一個整體75-77
• 3.1.8 PHF6 extended PHD2結(jié)構(gòu)域代表一種新的結(jié)構(gòu)模塊77-79
• 3.1.9 PHF6 extended PHD2結(jié)構(gòu)域非特異性結(jié)合雙鏈DNA79-84
• 3.1.10 PHF6 extended PHD2結(jié)構(gòu)域中的病理性點突變84-86
• 3.1.11 PHF6與NuRD復合物組分RBBP4直接相互作用86-87
• 3.1.12 PHF6介導的轉(zhuǎn)錄抑制依賴于其與RBBP4的相互作用87
• 3.2 討論87-90
• 3.2.1 PHF6的extended PHD結(jié)構(gòu)域代表一種新的結(jié)構(gòu)模塊87-89
• 3.2.2 BFLS,AML,T-ALL疾病中PHF6突變的影響89
• 3.2.3 PHF6與NuRD復合物組分RBBP4的直接相互作用對PHF6功能的提示89-90
• 3.3 總結(jié)90-93
• 第4章 PHF6與RBBP4相互作用的結(jié)構(gòu)與功能研究93-107
• 4.1 實驗結(jié)果93-103
• 4.1.1 重組RBBP4/RbAp48蛋白的表達與純化93-94
• 4.1.2 RBBP4與PHF6(157-171 aa)小肽的等溫滴定量熱(ITC)實驗94-95
• 4.1.3 RBBP4與PHF6小肽復合物晶體的獲得與結(jié)構(gòu)解析95-97
• 4.1.4 RBBP4與PHF6小肽間的相互作用細節(jié)97-98
• 4.1.5 PHF6的突變對RBBP4識別的影響98-100
• 4.1.6 RBBP4-PHF6復合物與其他RBBP4/RbAp46復合物的結(jié)構(gòu)比較100-102
• 4.1.7 PHF6的中間無序區(qū)域足以介導轉(zhuǎn)錄抑制,且是RBBP4中等程度依賴的102-103
• 4.2 討論103-105
• 4.2.1 PHF6-RBBP4間的相互作用是高度保守的104
• 4.2.2 PHF6,FOG1和組蛋白H3與RBBP4的相互作用是相互排斥的104-105
• 4.2.3 PHF6的突變可能影響受NuRD復合物調(diào)控的發(fā)育相關(guān)通路105
• 4.3 總結(jié)105-107
• 參考文獻107-113
• 附錄1113-114
• 附錄2114-115
• 附錄3115-159
• 致謝159-161
• 在讀期間發(fā)表的學術(shù)論文與取得的研究成果161

【共引文獻】

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