本文關(guān)鍵詞：唾液乳桿菌Ren抗膽鹽脅迫反應(yīng)機(jī)制及轉(zhuǎn)錄因子TF0225在膽鹽脅迫應(yīng)激中的作用

  更多相關(guān)文章： 唾液乳桿菌 膽鹽脅迫 RNA-Seq 蛋白質(zhì)雙向電泳 轉(zhuǎn)錄因子

【摘要】：唾液乳桿菌是人體腸道內(nèi)的原籍菌,具有多種益生功效。腸道內(nèi)的膽鹽具有殺菌作用,能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),造成蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊和DNA氧化損傷,因此能夠耐受生理?xiàng)l件下的膽鹽脅迫是唾液乳桿菌在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的必要條件。本研究采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白組學(xué)相結(jié)合的手段,對(duì)長壽老人源Lactobacillus salivarius Ren膽鹽脅迫反應(yīng)中的差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定,并對(duì)其中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因進(jìn)行功能分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為全面揭示L. salivariusRen的膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制提供理論基礎(chǔ),研究內(nèi)容如下：(1) L. salivarius Ren膽鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組和蛋白組圖譜的建立。將L. salivarius Ren在含有0.07%牛膽鹽(Oxgall)的MRS中進(jìn)行培養(yǎng),應(yīng)用基于第二代高通量測(cè)序的RNA-Seq方法篩選了192個(gè)轉(zhuǎn)錄水平顯著變化的基因(log2 fold_change≥1.5,p0.001),其中47個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),145個(gè)基因下調(diào)。同時(shí)采用蛋白質(zhì)雙向電泳(2-DE)和質(zhì)譜鑒定分離了44個(gè)胞內(nèi)可溶性差異表達(dá)蛋白點(diǎn)(fold_change≥1.25,p0.05),其中表達(dá)豐度上調(diào)的蛋白點(diǎn)15個(gè),下調(diào)29個(gè)；并且31個(gè)蛋白點(diǎn)在翻譯水平和轉(zhuǎn)錄水平同時(shí)呈現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)。結(jié)果表明L. salivarius Ren的膽鹽脅迫響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。(2)生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)L. salivarius Ren的膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制。利用Uniprot、KEGG及NCBI等數(shù)據(jù)庫分析差異表達(dá)基因和蛋白質(zhì)的功能及參與的代謝通路,提出了L. salivarius Ren的膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制,主要包括：對(duì)麥芽糖和甘油的利用加強(qiáng),加速糖酵解以提高能量物質(zhì)的產(chǎn)生；增加賴氨酸與蘇氨酸的合成,以加強(qiáng)對(duì)細(xì)胞表面的修飾提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性；轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的合成上調(diào)以加速膽鹽的泵出；提高分子伴侶與氧化還原酶的合成,應(yīng)對(duì)膽鹽造成的蛋白變性和氧化損傷；基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、細(xì)胞分裂增殖及脂肪酸合成等進(jìn)程減慢；通過轉(zhuǎn)錄因子及雙組分系統(tǒng)調(diào)控細(xì)胞生理變化,以適應(yīng)膽鹽脅迫環(huán)境。(3)轉(zhuǎn)錄因子TF0225在L. salivarius Ren膽鹽脅迫應(yīng)激中的調(diào)控機(jī)制。將TF0225在L.salivarius Ren中進(jìn)行同源超量表達(dá),膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄因子超量表達(dá)菌株對(duì)0.5%膽鹽的耐受能力是對(duì)照菌株的23倍。進(jìn)一步利用細(xì)菌單雜交和MEME工具預(yù)測(cè)了TF0225的DNA結(jié)合位點(diǎn)保守基序STKGMCA,并通過Target Explorer在L. salivarius Ren中篩選了16個(gè)TF0225的靶基因。采用RT-qPCR分析了關(guān)鍵靶基因.oppA的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄因子超量表達(dá)菌株中oppA的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)2.33倍,證實(shí)了TF0225對(duì)oppA的負(fù)調(diào)控作用。(4)靶基因oppA在L. salivarius Ren膽鹽脅迫抗性中的功能分析。將oppA基因在L. salivariusRen中進(jìn)行同源超量表達(dá),膽鹽耐受實(shí)驗(yàn)表明oppA超量表達(dá)的重組菌株對(duì)0.5%膽鹽的耐受能力是對(duì)照菌株的20倍。單一成份膽鹽(GCA、GDCA、TCA和TDCA)的耐受實(shí)驗(yàn)表明OppA可賦予重組菌株對(duì)牛磺酸結(jié)合膽鹽特異的抗性。此外,OppA的超量表達(dá)還可顯著提高L. salivarius Ren對(duì)高鹽(7.5% NaCl)及高溫(55。C)脅迫的耐受能力。這些結(jié)果表明OppA在L. salivarius Ren對(duì)抗多重脅迫的過程中發(fā)揮保護(hù)作用。綜上所述,本研究首次采用了轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)相結(jié)合的方法,全面分析了L. salivariusRen膽鹽脅迫條件下基因與蛋白的差異表達(dá)情況,為揭示L. salivarius的膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制提供了新的依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：唾液乳桿菌 膽鹽脅迫 RNA-Seq 蛋白質(zhì)雙向電泳 轉(zhuǎn)錄因子
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q933
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-13
• 縮略詞表13-15
• 第一章 引言15-25
• 1.1 唾液乳桿菌及其益生功效15
• 1.2 L.salrvarius Ren簡介15
• 1.3 腸道內(nèi)的膽鹽及膽鹽脅迫15-17
• 1.3.1 人體內(nèi)膽鹽的組成與代謝16-17
• 1.3.2 膽鹽對(duì)細(xì)菌的毒害作用17
• 1.4 乳桿菌的膽鹽脅迫抗性機(jī)制17-19
• 1.4.1 膽鹽水解酶17-18
• 1.4.2 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變18
• 1.4.3 膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)18-19
• 1.5 乳桿菌膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制的組學(xué)研究19-20
• 1.6 膽鹽脅迫應(yīng)激中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究20-22
• 1.6.1 轉(zhuǎn)錄因子與乳桿菌膽鹽脅迫應(yīng)激20-21
• 1.6.2 細(xì)菌單雜交21-22
• 1.7 本研究的目的及意義22-25
• 1.7.1 研究目的意義22-23
• 1.7.2 研究內(nèi)容23-24
• 1.7.3 技術(shù)路線24-25
• 第二章 L.salivarius Ren膽鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組和蛋白組圖譜的建立25-46
• 2.1 材料與試劑25-27
• 2.1.1 菌株25
• 2.1.2 試劑25
• 2.1.3 試劑的配制25-26
• 2.1.4 儀器設(shè)備26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法27-31
• 2.2.1 L.salivarius Ren膽鹽脅迫處理?xiàng)l件的確定27
• 2.2.2 L.salivarius Ren膽鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)錄組的測(cè)定27-28
• 2.2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的處理28
• 2.2.4 L.salivarius Ren膽鹽脅迫條件下蛋白組的測(cè)定28-30
• 2.2.5 蛋白組數(shù)據(jù)的處理30-31
• 2.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析31
• 2.3 結(jié)果與分析31-45
• 2.3.1 L.salivarius Ren膽鹽脅迫條件的確定31-32
• 2.3.2 L.salivarius Ren膽鹽脅迫條件下轉(zhuǎn)錄譜的建立32-39
• 2.3.3 L.salivarius Ren膽鹽脅迫條件下蛋白質(zhì)圖譜的建立39-41
• 2.3.4 差異表達(dá)蛋白的質(zhì)譜鑒定41-45
• 2.4 討論45-46
• 第三章 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)L.salivarius Ren的膽鹽脅迫應(yīng)激機(jī)制46-54
• 3.1 生物信息學(xué)分析工具46
• 3.2 生物信息學(xué)分析方法46
• 3.3 結(jié)果與討論46-54
• 3.3.1 中心代謝途徑的調(diào)整46-49
• 3.3.2 膽鹽脅迫抗性機(jī)制49-51
• 3.3.3 普遍脅迫響應(yīng)機(jī)制51
• 3.3.4 基因轉(zhuǎn)錄、翻譯及菌體增殖減緩51-52
• 3.3.5 轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的變化52-53
• 3.3.6 未知功能基因53-54
• 第四章 轉(zhuǎn)錄因子TF0225在L.salivarius Ren膽鹽脅迫應(yīng)激中的功能分析54-80
• 4.1 材料與試劑54-60
• 4.1.1 菌株和質(zhì)粒54-55
• 4.1.2 試劑55
• 4.1.3 試劑的配制55-60
• 4.1.4 儀器設(shè)備60
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法60-70
• 4.2.1 轉(zhuǎn)錄因子TF0225同源超量表達(dá)重組菌株的構(gòu)建60-63
• 4.2.2 TF0225超量表達(dá)菌株膽鹽耐受能力分析63-64
• 4.2.3 細(xì)菌單雜交誘餌載體pB 1H2w2-25的構(gòu)建64
• 4.2.4 Western blot檢測(cè)Omega-0225融合蛋白的表達(dá)64-66
• 4.2.5 細(xì)菌單雜交預(yù)測(cè)TF0225的DNA結(jié)合序列66-67
• 4.2.6 生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)TF0225的靶基因67-68
• 4.2.7 RT-qPCR檢測(cè)TF0225對(duì)靶基因oppA的轉(zhuǎn)錄調(diào)控68-70
• 4.3 結(jié)果與分析70-79
• 4.3.1 轉(zhuǎn)錄因子TF0225同源超量表達(dá)載體的構(gòu)建70-72
• 4.3.2 重組菌株膽鹽脅迫耐受能力分析72-73
• 4.3.3 轉(zhuǎn)錄因子TF0225在細(xì)菌單雜交宿主E.coli USO中的表達(dá)73-74
• 4.3.4 細(xì)菌單雜交預(yù)測(cè)TF0225的DNA識(shí)別序列74-75
• 4.3.5 Target Explorer預(yù)測(cè)TF0225調(diào)控的靶基因75-77
• 4.3.6 RT-qPCR驗(yàn)證TF0225對(duì)靶基因oppA的調(diào)控77-79
• 4.4 討論79-80
• 第五章 靶基因oppA在L.salivarius Ren膽鹽脅迫抗性中的功能分析80-92
• 5.1 材料與試劑80-82
• 5.1.1 菌株和質(zhì)粒80
• 5.1.2 試劑80-81
• 5.1.3 試劑的配制81
• 5.1.4 儀器設(shè)備81-82
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法82-85
• 5.2.1 oppA基因的PCR擴(kuò)增82
• 5.2.2 重組質(zhì)粒p11-oppA的構(gòu)建82-83
• 5.2.3 oppA超量表達(dá)菌株的構(gòu)建83
• 5.2.4 OppA蛋白物理化學(xué)性質(zhì)預(yù)測(cè)83
• 5.2.5 SDS-PAGE檢測(cè)OppA蛋白的超量表達(dá)83-84
• 5.2.6 重組菌株LSRoppA膽鹽脅迫抗性能力分析84
• 5.2.7 重組菌株LSRoppA對(duì)單組分膽鹽的耐受偏好性分析84
• 5.2.8 重組菌株LSRoppA對(duì)于其他脅迫的耐受能力分析84-85
• 5.3 結(jié)果與分析85-90
• 5.3.1 oppA基因的擴(kuò)增85
• 5.3.2 OppA超量表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建85-86
• 5.3.3 OppA超量表達(dá)菌株的構(gòu)建86
• 5.3.4 OppA蛋白序列分析86-87
• 5.3.5 SDS-PAGE檢測(cè)OppA蛋白的超量表達(dá)87-88
• 5.3.6 重組菌株LSRoppA膽鹽脅迫抗性能力分析88-89
• 5.3.7 重組菌株LSRoppA對(duì)單組分膽鹽的耐受偏好性分析89
• 5.3.8 重組菌株LSRoppA對(duì)于其他脅迫的耐受能力分析89-90
• 5.4 討論90-92
• 第六章 全文總結(jié)與展望92-95
• 6.1 全文總結(jié)92
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)92-93
• 6.3 展望93-95
• 參考文獻(xiàn)95-102
• 致謝102-103
• 附錄103-105
• 個(gè)人簡介105

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 孟祥晨;李雪;姚蕾;周金雨;;兩株植物乳桿菌作為潛在益生菌的體外評(píng)價(jià)[J];東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào);2015年09期

2 敖曉琳;蒲彪;蔡義民;胡愛華;陳岑;陳安均;;發(fā)酵乳桿菌及其益生特性研究進(jìn)展[J];食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào);2015年02期

3 周建良;徐中文;李浩;李慧梅;劉智偉;方祥;;唾液乳桿菌LB-2P發(fā)酵培養(yǎng)基的響應(yīng)面分析優(yōu)化[J];中國食品學(xué)報(bào);2015年07期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 杜新永;產(chǎn)α-半乳糖苷酶唾液乳桿菌XH4B篩選、性質(zhì)、應(yīng)用及高密度培養(yǎng)研究[D];浙江大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：614162