本文關(guān)鍵詞：優(yōu)化設(shè)計(jì)并人工合成的納豆激酶基因在甜瓜和番茄中的高效表達(dá)

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【摘要】：納豆激酶(nattokinase,NK)是由納豆枯草桿菌(Bacillus subtilis var. natto)分泌的一種堿性蛋白酶,其活性發(fā)揮依賴直接和間接兩種途徑,具有很強(qiáng)的溶解血栓纖維蛋白的活性。其安全、可口服、方便有效等優(yōu)點(diǎn),使得它作為一種新型的口服溶栓劑,在預(yù)防和治療心血管疾病方面具有很好的應(yīng)用前景。本論文克隆了納豆枯草桿菌來(lái)源的納豆激酶基因aprN(eNK),根據(jù)植物密碼子的使用頻率,以不改變NK氨基酸序列為前提,重新優(yōu)化設(shè)計(jì)該基因,獲得了人工合成的納豆激酶基因sNK。利用重疊延伸PCR技術(shù),在上述兩種基因中插入番茄果實(shí)特異性表達(dá)基因E8的第一內(nèi)含子構(gòu)成eNKi和sNKi基因。在上述四種基因的起始密碼子ATG前插入Kozak序列,以植物雙元表達(dá)載體pPZP221(35S-nos)為構(gòu)建的初始載體,將這四種納豆激酶基因——-eNK、eNKi、 sNK和sNK1分別克隆到組成型表達(dá)的CaMV 35S啟動(dòng)子和果實(shí)特異性表達(dá)的E8啟動(dòng)子下游,構(gòu)建8種植物表達(dá)載體：p35S-eNK、pE8-eNK、p35S-eNKi、 pE8-eNKi、p35S-sNK、pE8-sNK、p35S-sNKi和pE8-sNKi,凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404。通過(guò)農(nóng)桿菌滲透法將四種納豆激酶基因注射到甜瓜品種河套蜜瓜(Cucumis melo L.cv Hetao)果實(shí)中并實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)表達(dá)。通過(guò)正交試驗(yàn)摸索得到在甜瓜果實(shí)中瞬時(shí)表達(dá)納豆激酶基因的最優(yōu)條件：乙酰丁香酮濃度為250μmol/L、農(nóng)桿菌濃度OD600=0.6及注射后5天采收果實(shí),納豆激酶的表達(dá)量最高。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-qPCR)比較四種基因在不同成熟時(shí)期的甜瓜果實(shí)中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量；通過(guò)纖維蛋白平板法檢測(cè)四種基因表達(dá)產(chǎn)物的纖溶酶活性。RT-qPCR結(jié)果表明,經(jīng)密碼子優(yōu)化的sNK和sNKi基因的表達(dá)量顯著高于未改造的eNK和eNKi基因的表達(dá)量,其中35S啟動(dòng)子調(diào)控下的sNK因平均表達(dá)量為eNK因的8.64倍,而E8啟動(dòng)子調(diào)控下的sNKi基因則為eNKi基因平均表達(dá)量的10.93倍。E8啟動(dòng)子調(diào)控下的sNK和iNKi基因的表達(dá)量較組成型35S啟動(dòng)子調(diào)控下的該基因的表達(dá)量明顯提高,在果實(shí)成熟中期表達(dá)量達(dá)到最高。內(nèi)含子在sNKi基因的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程中能夠被正確的剪切掉,sNKi基因和sNK基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物相同,但sNKi基因的表達(dá)量高于無(wú)內(nèi)含子的sNK基因,表明內(nèi)含子對(duì)納豆激酶基因的瞬時(shí)表達(dá)具有顯著的促進(jìn)作用。纖溶酶活性測(cè)定結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果基本一致,纖維蛋白平板法在sNKK和sNKi基因的瞬時(shí)表達(dá)樣品中均能檢測(cè)到纖溶酶活性,表明目的基因在甜瓜果實(shí)中可正常翻譯并表現(xiàn)出溶栓活性,且E8啟動(dòng)子調(diào)控下的sNKi基因表達(dá)產(chǎn)物的纖溶酶活性最高,可達(dá)237.90 U/g。將sNK和iNKi基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)化Moneymaker和Micro-Tom番茄(Lycopersicon esculentum Mill)果實(shí),其納豆激酶基因的表達(dá)情況和甜瓜中類似。sNK和sNKi基因在番茄果實(shí)的轉(zhuǎn)色期、成熟期和完熟期都能表達(dá),其中成熟期表達(dá)量最高,破色期基本無(wú)表達(dá)。在E8啟動(dòng)子的調(diào)控下,sNKi基因表達(dá)的最高纖溶酶活可達(dá)144.27 U/g。通過(guò)農(nóng)桿菌侵染的方法將sNK和sNKi基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)化到Moneymaker、M82和Micro-Tom三種番茄中。T0代轉(zhuǎn)基因番茄經(jīng)PCR檢測(cè),分別得到轉(zhuǎn)p35S-sNK番茄32株,轉(zhuǎn)pE8-sNK番茄27株,轉(zhuǎn)p35S-sNKi番茄21株和轉(zhuǎn)pE8-sNKi番茄27株,初步證明目的基因已整合到番茄基因組中。經(jīng)加代培養(yǎng)得到T,代轉(zhuǎn)基因番茄植株,在轉(zhuǎn)p35S-sNK番茄中,有11株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),7株檢測(cè)到纖溶酶活性；在轉(zhuǎn)pE8-sNK番茄中,有12株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),8株檢測(cè)到纖溶酶活性；在轉(zhuǎn)p35S-sNKi番茄中,有8株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),6株檢測(cè)到纖溶酶活性；在轉(zhuǎn)pE8-sNKi番茄中,有11株檢測(cè)到轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),10株檢測(cè)到纖溶酶活性。其中,Moneymaker番茄的ADl-3植株表達(dá)產(chǎn)物的纖溶酶活性最高,為30.69 U/g。將表達(dá)出纖溶活性的T1代轉(zhuǎn)基因番茄繼續(xù)加代培養(yǎng),得到T2代轉(zhuǎn)基因番茄,檢測(cè)到納豆激酶基因表達(dá)的共有轉(zhuǎn)p35S-sNK番茄9個(gè)株系、28個(gè)植株,轉(zhuǎn)pE8-sNK番茄8個(gè)株系、27個(gè)植株,轉(zhuǎn)p35S-sNKi番茄8個(gè)株系、25個(gè)植株和轉(zhuǎn)pE8-sNKi番茄10個(gè)株系、36個(gè)植株。其中, Moneymaker番茄的AD1-3-3植株表達(dá)的纖溶酶活性可高達(dá)63.90U/g。
【關(guān)鍵詞】：納豆激酶 密碼子優(yōu)化 內(nèi)含子 瞬時(shí)表達(dá) 番茄 甜瓜
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-13
• 符號(hào)說(shuō)明13-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-34
• 1.1 納豆激酶及其基因的研究進(jìn)展15-24
• 1.1.1 納豆激酶及其基因的分子結(jié)構(gòu)15-16
• 1.1.2 納豆激酶的理化性質(zhì)16-17
• 1.1.3 納豆激酶的溶栓活性與活性測(cè)定方法17-21
• 1.1.4 納豆激酶基因表達(dá)的研究21-22
• 1.1.5 納豆激酶的應(yīng)用前景22-24
• 1.2 外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中高效表達(dá)的研究進(jìn)展24-26
• 1.2.1 蛋白質(zhì)靶向定位24
• 1.2.2 優(yōu)化外源基因密碼子24-25
• 1.2.3 啟動(dòng)子的選擇和改造25
• 1.2.4 添加5’和3’非編碼序列25-26
• 1.2.5 使用核基質(zhì)附著區(qū)(MARs)序列26
• 1.2.6 插入內(nèi)含子26
• 1.3 植物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白的研究進(jìn)展26-32
• 1.3.1 植物生物反應(yīng)器的優(yōu)點(diǎn)27
• 1.3.2 植物表達(dá)系統(tǒng)27-31
• 1.3.3 植物生物反應(yīng)器的應(yīng)用31-32
• 1.4 本研究的目的和意義32-34
• 第二章 納豆激酶基因密碼子的優(yōu)化設(shè)計(jì)、合成及植物表達(dá)載體的構(gòu)建34-54
• 2.1 材料和試劑34-35
• 2.1.1 菌種、質(zhì)粒34-35
• 2.1.2 主要試劑35
• 2.1.3 溶液和培養(yǎng)基配方35
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法35-44
• 2.2.1 納豆激酶基因eNK的克隆35-37
• 2.2.2 納豆激酶基因eNKi的構(gòu)建37-39
• 2.2.3 納豆激酶基因sNK的設(shè)計(jì)與合成39-40
• 2.2.4 納豆激酶基因sNKi的構(gòu)建40-41
• 2.2.5 納豆激酶基因eNK,eNKi和sNK,sNKi植物表達(dá)載體的構(gòu)建41-44
• 2.3 結(jié)果與分析44-52
• 2.3.1 eNK基因的克隆與eNKi基因的構(gòu)建結(jié)果44-46
• 2.3.2 sNK基因的合成與sNKi基因的構(gòu)建結(jié)果46-49
• 2.3.3 eNK和eNKi基因植物表達(dá)載體的獲得49-51
• 2.3.4 sNK和sNKi基因植物表達(dá)載體的獲得51-52
• 2.4 討論52-54
• 第三章 人工合成的納豆激酶基因在甜瓜和番茄果實(shí)中的瞬時(shí)表達(dá)54-79
• 3.1 材料和試劑55-56
• 3.1.1 植物材料55
• 3.1.2 菌種、質(zhì)粒55
• 3.1.3 主要試劑55
• 3.1.4 引物設(shè)計(jì)55-56
• 3.1.5 溶液和培養(yǎng)基配方56
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法56-64
• 3.2.1 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA440456-58
• 3.2.2 甜瓜果實(shí)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立58-62
• 3.2.3 番茄果實(shí)瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的建立62-64
• 3.3 結(jié)果與分析64-76
• 3.3.1 轉(zhuǎn)納豆激酶基因植物表達(dá)載體農(nóng)桿菌的獲得64-65
• 3.3.2 納豆激酶基因在甜瓜果實(shí)中瞬時(shí)表達(dá)的分析65-73
• 3.3.3 納豆激酶基因在番茄果實(shí)中瞬時(shí)表達(dá)的分析73-76
• 3.4 討論76-79
• 第四章 人工合成的納豆激酶基因在番茄中的穩(wěn)定表達(dá)79-102
• 4.1 材料和試劑82-83
• 4.1.1 植物材料82
• 4.1.2 菌種、質(zhì)粒82
• 4.1.3 主要試劑82
• 4.1.4 引物82
• 4.1.5 溶液和培養(yǎng)基配方82-83
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法83-88
• 4.2.1 番茄組織培養(yǎng)再生體系的建立83-84
• 4.2.2 番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立84-86
• 4.2.3 T_0代轉(zhuǎn)基因番茄植株的檢測(cè)86-87
• 4.2.4 轉(zhuǎn)基因番茄植株的加代培養(yǎng)87-88
• 4.3 結(jié)果與分析88-100
• 4.3.1 番茄高效組織培養(yǎng)再生體系的獲得88-91
• 4.3.2 納豆激酶基因轉(zhuǎn)化番茄實(shí)驗(yàn)結(jié)果91-94
• 4.3.3 T_0代轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得94-96
• 4.3.4 T_1代轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得與表達(dá)分析96-99
• 4.3.5 T_2代轉(zhuǎn)基因番茄植株的獲得與表達(dá)分析99-100
• 4.4 討論100-102
• 結(jié)論102-103
• 參考文獻(xiàn)103-113
• 致謝113-114
• 攻讀博士學(xué)位期間論文發(fā)表情況114

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9 柴q，

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