本文關(guān)鍵詞：白腐真菌漆酶及同工酶基因家族的克隆表達(dá)調(diào)控研究

  更多相關(guān)文章： 白腐真菌 漆酶基因 漆酶基因家族 異源表達(dá) 重組漆酶 表達(dá)調(diào)控

【摘要】：漆酶(p-diphenol:oxygen oxidoreductase; EC1.10.3.2)是一類含銅多酚氧化酶,其廣泛分布于高等植物及真菌中,是白腐真菌特異胞外降解酶系中的重要組分。白腐真菌漆酶與木質(zhì)素降解、酚類物質(zhì)的氧化、色素合成、孢子形成以及子實(shí)體分化等多種功能有著密切聯(lián)系。由于漆酶有著廣泛的底物作用范圍及重要的生物降解功能,其在造紙工業(yè)、生物燃料、食品加工、染料脫色、工業(yè)廢水處理等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用潛力和開發(fā)價(jià)值。因此,開展漆酶基因資源的獲取、表達(dá)調(diào)控等方面的研究對(duì)于豐富漆酶基因資源及解析漆酶基因家族及功能,促進(jìn)漆酶高效表達(dá)具有重要的理論意義及應(yīng)用價(jià)值。本論文以白腐真菌漆酶為核心,進(jìn)行了漆酶基因的克隆、異源表達(dá)、重組漆酶的特性以及漆酶基因家族的表達(dá)調(diào)控等一系列的研究,具體研究結(jié)果如下： 以白腐真菌Ganoderma sp. En3, Pleurotus ostreatus BP2為出發(fā)菌株,利用簡(jiǎn)并引物PCR、TAIL-PCR、RT-PCR、SEFA-PCR、保守引物PCR技術(shù),從菌株En3中克隆得到一條漆酶結(jié)構(gòu)基因lac-En3-1及其全長(zhǎng)cDNA序列；從菌株BP2中得到了漆酶基因家族11條不同漆酶同工酶的cDNA序列及相應(yīng)漆酶基因上游調(diào)控序列。對(duì)相應(yīng)漆酶基因調(diào)控序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明漆酶基因上游序列中存在多個(gè)順式作用調(diào)控元件如金屬響應(yīng)元件MRE、異生物質(zhì)響應(yīng)元件XRE、CreA結(jié)合位點(diǎn)、NIT2結(jié)合位點(diǎn)等。 將來源自Ganoderma sp. En3的漆酶基因lac-En3-1進(jìn)行了畢赤酵母異源表達(dá),得到了具有漆酶活力的酵母轉(zhuǎn)化子,驗(yàn)證了其漆酶功能。對(duì)重組漆酶蛋白rLAC-En3-1進(jìn)行了分離純化并研究了其酶學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)rLAC-En3-1在pH大于7的堿性環(huán)境中具有較高的穩(wěn)定性,同時(shí)對(duì)一些酶類抑制劑如SDS、EDTA,及工業(yè)中常用的金屬離子和有機(jī)溶劑等有較好的耐受性,并在染料降解及脫毒方面顯示出良好效果。 通過分別添加不同類型的誘導(dǎo)物如金屬離子,芳香化合物,金屬離子和芳香化合物的組合及醇類等,研究了白腐真菌Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因家族不同漆酶同工酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控情況,結(jié)果顯示：銅離子顯著促進(jìn)Pleurotus ostreatus BP2漆酶同工酶所有基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),而鐵、錳、鉻等其它金屬離子則對(duì)部分漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)顯示出誘導(dǎo)作用。發(fā)現(xiàn)了顯著誘導(dǎo)Pleurotus ostreatus BP2基因家族轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的7種芳香化合物,不同芳香化合物的誘導(dǎo)作用存在差異。金屬離子和芳香化合物的組合誘導(dǎo)對(duì)Pleurotus ostreatus BP2部分漆酶基因有明顯協(xié)同效果。在醇類誘導(dǎo)及其它條件下Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平也有所上調(diào)。 進(jìn)一步通過Time Course實(shí)驗(yàn)研究了若干種芳香族化合物對(duì)于Pleurotus ostreatus BP2漆酶同工酶基因轉(zhuǎn)錄的影響,發(fā)現(xiàn)肉桂酸、3,4,5-三甲氧基肉桂酸、3,4-二甲氧基肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、香草酸在第8天對(duì)Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)效果明顯,4-甲氧基肉桂酸、3-羥基-4甲氧基肉桂酸在第10天對(duì)Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)效果明顯。 綜上所述,本論文從Ganoderma sp.En3中克隆得到一條漆酶基因lac-En3-1,從Pleurotus ostreatus BP2中克隆得到了11條不同漆酶同工酶基因cDNA及其上游調(diào)控區(qū)域。將lac-En3-1漆酶編碼基因進(jìn)行了畢赤酵母異源表達(dá),純化得到的重組漆酶rLAC-En3-1具有較好的有機(jī)溶劑、金屬離子耐受性以及合成染料脫毒脫色能力。研究了不同誘導(dǎo)條件下Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因家族轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控情況,發(fā)現(xiàn)多種金屬離子、芳香化合物、醇類等對(duì)于漆酶基因家族的轉(zhuǎn)錄具有誘導(dǎo)上調(diào)作用。
【關(guān)鍵詞】：白腐真菌 漆酶基因 漆酶基因家族 異源表達(dá) 重組漆酶 表達(dá)調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 1 緒論10-33
• 1.1 白腐真菌及其木質(zhì)素降解酶系10-13
• 1.2 漆酶的分布及本研究漆酶來源13-14
• 1.3 白腐真菌漆酶的結(jié)構(gòu)14-15
• 1.4 白腐真菌漆酶的特性15-17
• 1.5 白腐真菌漆酶的催化反應(yīng)機(jī)制與介體系統(tǒng)17-18
• 1.6 漆酶的應(yīng)用18-20
• 1.7 漆酶的分子生物學(xué)研究進(jìn)展20-27
• 1.8 漆酶同工酶的研究27-30
• 1.9 本論文研究思路,技術(shù)路線和主要研究?jī)?nèi)容30-33
• 2 白腐真菌Ganoderma sp.En3和Pleurotus ostreatus BP2的漆酶基因及其上游調(diào)控序列的克隆與分析33-75
• 2.1 引言33
• 2.2 材料和方法33-46
• 2.3 結(jié)果與討論46-74
• 2.4 本章小結(jié)74-75
• 3 白腐真菌Ganoderma sp.En3漆酶基因在畢赤酵母中的異源表達(dá)及重組漆酶的性質(zhì)和染料脫色降解研究75-102
• 3.1 引言75-76
• 3.2 材料和方法76-85
• 3.3 結(jié)果與討論85-101
• 3.4 本章小結(jié)101-102
• 4 不同誘導(dǎo)物對(duì)白腐真菌Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因家族不同漆酶同工酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究102-143
• 4.1 引言102
• 4.2 材料與方法102-106
• 4.3 結(jié)果與討論106-142
• 4.4 本章小結(jié)142-143
• 5 芳香化合物誘導(dǎo)Pleurotus ostreatus BP2漆酶基因家族轉(zhuǎn)錄的TimeCourse分析143-157
• 5.1 引言143
• 5.2 材料和方法143-145
• 5.3 結(jié)果與討論145-156
• 5.4 本章小結(jié)156-157
• 6 全文總結(jié)157-160
• 6.1 主要結(jié)論157-158
• 6.2 創(chuàng)新性158-159
• 6.3 展望159-160
• 致謝160-163
• 參考文獻(xiàn)163-183
• 附錄1 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文183-184
• 附錄2 本文涉及的基因序列信息184-197

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本文編號(hào)：520651