發(fā)布時間：2017-06-27 02:11

  本文關(guān)鍵詞：碳離子束輻照擬南芥突變體篩選及誘變效應(yīng)研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：重離子束因其獨特的物理學(xué)和生物學(xué)優(yōu)勢,在輻射育種中具有突變率高、誘變譜廣等優(yōu)點,是植物品種改良的重要手段之一。目前許多農(nóng)作物的遺傳背景不清晰,在一定程度上限制了輻射育種分子機理的研究進展。本研究以模式植物擬南芥為研究對象,采用碳離子束輻照誘變處理,對M2代群體進行突變率及誘變譜量化分析,并對篩選到的穩(wěn)定突變體#197進行表型、生理生化及非生物脅迫抗性分析,借助全基因組重測序技術(shù)分析獲取了該突變體在DNA水平上的變異類型及分布特征,結(jié)合圖位克隆技術(shù)探尋引起突變性狀的基因。力求從表型和基因組學(xué)層面解析碳離子束輻照對擬南芥的誘變生物學(xué)效應(yīng),進而為重離子束輻照誘變育種提供理論基礎(chǔ)。在室溫和大氣條件下采用能量分別為43.3Me V/u和10.3Me V/u(樣品平均LET分別為50 ke V/μm和200 ke V/μm)的碳離子束輻射擬南芥干種子,對擬南芥當(dāng)代生物學(xué)效應(yīng)進行分析。同一LET條件下,除株高外,存活率、根長、下胚軸長及每果莢種子數(shù)均隨著輻射劑量的增大呈現(xiàn)出下降趨勢;碳離子束的LET值越高,存活率、根長、下胚軸長度及每果莢種子數(shù)等指標(biāo)下降的程度越劇烈。綜合考慮,以獲取高的突變率及育性良好的突變后代為前提,選取50 ke V/μm,200Gy處理組用于大規(guī)模突變篩選。從28602株M2植物材料中篩選到肉眼可識別的表型變異植株共計1363份,變異類型包括4個大類,即葉突變、莖突變、花突變、生長周期突變,每一大類又可分為多種的亞類,統(tǒng)計分析結(jié)果顯示:碳離子束輻照對擬南芥的總突變率為4.77%,其中葉和生長周期突變比例較高,分別為2.33%和1.57%;而莖和花的突變率則僅為0.27%和0.13%。同時也發(fā)現(xiàn)碳離子束輻照對擬南芥具有明顯的表型多效性:在篩選到的1363份突變材料中,表現(xiàn)出一種明顯表型的突變體所占比率為64%;表現(xiàn)出兩種明顯表型的突變材料占13.3%;13.1%的突變體表現(xiàn)出3種及3種以上的表型。對碳離子束輻照誘變所獲得的穩(wěn)定遺傳突變體#197進行表型深入研究,結(jié)果表明營養(yǎng)生長階段,#197主根長度、下胚軸長度、鮮重及株高均比野生型(Wild type,WT)低。表型組學(xué)統(tǒng)計觀察顯示#197的葉片總面積顯著低于WT,葉片熒光強度也較WT弱。#197的第一到第三片真葉比WT面積大,早期生長時中心葉片薄而透,顏色深綠,后期蓮座葉片上呈凹凸不平狀。對差異葉片進行顯微觀察發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部細胞形態(tài)也發(fā)生了相應(yīng)改變。葉綠素?zé)晒鈾z測結(jié)果表明與WT相比,#197的PSⅡ活性降低,主要表現(xiàn)為Fv/Fm、ΦPSⅡ、ETR及q P值的下降。此外,#197的生殖生長表現(xiàn)出開花時間晚,花粉活力弱,果莢發(fā)育差等特征。借助基因組重測序技術(shù)分析并鑒定了#197突變體基因組的序列變異及結(jié)構(gòu)變異信息。測序共產(chǎn)生5.9億堿基對,平均測序深度達參考基因組的49×。檢測出變異主要包括4642個SNP、3071個Indel、79個CNV、288個SV。通過對SNP和Indel在染色體上的分布情況來看,碳離子輻照引起的突變在各染色體上具有一定的偏好性,且主要集中在著絲粒附近,1號染色體上的突變尤為集中。堿基發(fā)生A-G、T-C轉(zhuǎn)換與A-C、A-T、G-C、G-T顛換的比值(Ti/Tv)為0.996:1。對變異位點進行GO注釋,發(fā)現(xiàn)參與生物學(xué)途徑的基因變異所占比率為47%,參與細胞組分及分子功能的基因變異所占比率分別為27%和26%。利用圖位克隆技術(shù),將與#197突變體性狀相關(guān)的變異位點鎖定在1號染色體上的T23K8至F4N2的1832kb范圍內(nèi)以及4號染色體上的F6I18至F8B4的579.773kb的范圍內(nèi)。將圖位克隆與基因組重測序結(jié)果相結(jié)合,確定與#197的突變性狀相關(guān)的候選基因共計32個。比較了#197突變體與WT對鹽及干旱脅迫的敏感性:鹽脅迫降低了WT與#197種子的萌發(fā)速率卻并沒有抑制擬南芥的最終萌發(fā)率。在幼苗期,鹽脅迫處理后,#197綠胚率比WT高,且其脯氨酸合成酶基因P5CS1表達水平顯著高于WT。正常條件下,#197與WT的含水量無差異,干旱脅迫后,#197的失水率較WT高,脯氨酸積累量較WT低,某些關(guān)鍵標(biāo)記基因表達量較WT低,但是二者對干旱脅迫的敏感性在表型上無明顯差異。綜合以上研究結(jié)果表明:1)碳離子束輻照對擬南芥干種子具有明顯的當(dāng)代效應(yīng),綜合半致死劑量、生長情況及育性等指標(biāo),選取50 ke V/μm,200Gy處理組用于大規(guī)模突變篩選。2)碳離子束對擬南芥M2群體的總突變率為4.77%,突變譜包括葉突變、莖突變、花突變、生育周期突變,同時碳離子束輻照擬南芥誘發(fā)的突變具有明顯的表型多效性。3)對穩(wěn)定遺傳的突變體#197進行表型深入研究發(fā)現(xiàn),與野生型植株相比,#197在營養(yǎng)生長及生殖生長階段均呈現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)差異,呈現(xiàn)出生長發(fā)育延遲且長勢較弱的趨勢。4)#197突變體在DNA水平上發(fā)生了數(shù)目眾多的倒位、易位、插入缺失和點突變。5)圖位克隆發(fā)現(xiàn)與#197表型性狀相關(guān)的突變基因分別位于1號和4號染色體上。6)#197在幼苗期對鹽脅迫敏感性較WT低;雖然表型上#197對干旱脅迫的敏感性與WT無區(qū)別,但是其生理指標(biāo)及脅迫應(yīng)答基因的表達水平表現(xiàn)出了明顯的差異。
【關(guān)鍵詞】：碳離子束輻照 擬南芥 突變篩選 誘變效應(yīng) 全基因組重測序 圖位克隆
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院（近代物理研究所）
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q947.9
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-10
• ABSTRACT10-19
• 第一章 引言19-55
• 1.1 植物突變體的產(chǎn)生方式及機制19-23
• 1.1.1 自發(fā)突變19
• 1.1.2 化學(xué)誘變19-20
• 1.1.3 生物手段20-22
• 1.1.3.1 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法20-21
• 1.1.3.2 T-DNA插入21-22
• 1.1.4 物理手段22-23
• 1.2 重離子束輻射育種介紹23-34
• 1.2.1 重離子束物理學(xué)優(yōu)勢23-24
• 1.2.2 重離子束生物學(xué)優(yōu)勢24-26
• 1.2.3 重離子束輻照植物的誘變效應(yīng)26-28
• 1.2.4 重離子束輻照育種研究進展28-34
• 1.3 突變體研究技術(shù)34-46
• 1.3.1 圖位克隆34-36
• 1.3.1.1 圖位克隆原理34-35
• 1.3.1.2 擬南芥圖位克隆基本路線35-36
• 1.3.2 高通量測序36-41
• 1.3.2.1 測序技術(shù)的發(fā)展36-38
• 1.3.2.2 全基因組重測序技術(shù)38-41
• 1.3.3 TILLING技術(shù)41-43
• 1.3.3.1 TILLING技術(shù)原理及基本步驟41-42
• 1.3.3.2 TILLING技術(shù)的發(fā)展及研究進展42-43
• 1.3.4 表型組學(xué)43-46
• 1.4 擬南芥突變體研究進展46-52
• 1.4.1 擬南芥作為模式植物的特征46-48
• 1.4.1.1 植物學(xué)特征46-47
• 1.4.1.2 遺傳分析特征47-48
• 1.4.2 擬南芥突變表型分類篩選研究進展48-52
• 1.5 植物抗性的產(chǎn)生及分子機制52-53
• 1.6 研究意義53-55
• 第二章 材料和方法55-70
• 2.1 實驗材料55
• 2.1.1 擬南芥材料55
• 2.1.2 試劑55
• 2.2 實驗方法55-69
• 2.2.1 輻照實驗55-56
• 2.2.2 當(dāng)代生物學(xué)效應(yīng)測定56
• 2.2.3 碳離子束輻照擬南芥突變體篩選56-57
• 2.2.4 突變體表型分析及數(shù)據(jù)統(tǒng)計57-60
• 2.2.4.1 葉片下表皮細胞印記觀察57-58
• 2.2.4.2 葉片亞細胞結(jié)構(gòu)觀察58
• 2.2.4.3 葉片細胞結(jié)構(gòu)半薄切片觀察58-59
• 2.2.4.4 花粉活力測定59-60
• 2.2.4.5 果莢及種子發(fā)育檢測60
• 2.2.4.6 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定60
• 2.2.5 基因組重測序60-62
• 2.2.5.1 DNA提取-試劑盒法60-61
• 2.2.5.2 測序及信息分析61-62
• 2.2.6 基因圖位克隆62-65
• 2.2.6.1 定位群體構(gòu)建62
• 2.2.6.2 基因定位62-65
• 2.2.7 植物材料的Na Cl、ABA及干旱處理65
• 2.2.8 植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定65-67
• 2.2.8.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制65-66
• 2.2.8.2 樣品的測定66-67
• 2.2.9 熒光定量PCR67-69
• 2.2.9.1 引物設(shè)計67
• 2.2.9.2 RNA的提取67-68
• 2.2.9.3 第一鏈cDNA的合成68-69
• 2.2.9.4 熒光定量反應(yīng)69
• 2.3 實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析69-70
• 第三章 碳離子束輻照對擬南芥的當(dāng)代效應(yīng)研究及突變篩選70-82
• 3.1 不同參數(shù)的碳離子束輻照對擬南芥M1代存活率的影響70
• 3.2 不同參數(shù)的碳離子束輻照對擬南芥M1代根長及下胚軸的影響70-73
• 3.3 不同參數(shù)的碳離子束輻照對擬南芥M1代株高的影響73
• 3.4 不同參數(shù)的碳離子束輻照對擬南芥M1代育性的影響73-74
• 3.5 突變體篩選74
• 3.6 突變表型分類統(tǒng)計74-77
• 3.7 碳離子束輻照誘變對M2植株群體的表型多效性77-78
• 3.8 討論78-82
• 3.8.1 碳離子束輻照對擬南芥具有明顯的當(dāng)代效應(yīng)78-80
• 3.8.2 擬南芥M2群體表型變異豐富80-82
• 第四章 碳離子束輻照誘變獲取的擬南芥突變體82-124
• 4.1 突變體#197表型量化統(tǒng)計分析82-84
• 4.2 #197葉片表型變異分析84-89
• 4.2.1 #197蓮座葉的形態(tài)結(jié)構(gòu)變異84-87
• 4.2.2 #197蓮座葉葉綠素?zé)晒鈾z測87-89
• 4.3 #197育性相關(guān)變異分析89-91
• 4.4 碳離子束輻照對#197基因組水平的誘變效應(yīng)91-106
• 4.4.1 #197的DNA質(zhì)量檢測及文庫構(gòu)建91-93
• 4.4.2 Illumina測序clean date基本信息93-94
• 4.4.3 與參考基因組比對94-95
• 4.4.4 變異檢測95-104
• 4.4.4.1 SNP和小Indel檢測95-96
• 4.4.4.2 SNP和In Del在基因組的空間分布96-101
• 4.4.4.3 CNV和SV分析101-104
• 4.4.5 GO注釋104-106
• 4.5 #197基因圖位克隆106-110
• 4.5.1 #197的遺傳分析106
• 4.5.2 #197圖位克隆粗定位與精細定位106-108
• 4.5.3 #197圖位克隆與基因組重測序關(guān)聯(lián)分析108-110
• 4.6 #197突變體對氯化鈉及干旱處理敏感性初步研究110-117
• 4.6.1 #197突變體對NaCl及干旱脅迫的表型及生理指標(biāo)分析110-113
• 4.6.1.1 #197突變體對NaCl脅迫的表型敏感性鑒定110-113
• 4.6.1.2 #197突變體對干旱脅迫的表型敏感性鑒定113
• 4.6.2 脅迫響應(yīng)基因的表達水平檢測113-117
• 4.6.2.1 鹽脅迫響應(yīng)基因的表達水平檢測114-116
• 4.6.2.2 干旱脅迫響應(yīng)基因表達水平檢測116-117
• 4.7 討論117-124
• 4.7.1 #197表型發(fā)生明顯變異117-118
• 4.7.2 碳離子束輻照誘發(fā)的突變影響了118-119
• 4.7.3 碳離子束輻照誘發(fā)了119-121
• 4.7.4 碳離子束輻照誘發(fā)的突變影響了121-124
• 第五章 結(jié)論與展望124-127
• 5.1 結(jié)論124-125
• 5.2 進一步的工作方向125-127
• 參考文獻127-147
• 附錄一 縮略詞表147-150
• 附錄二 在讀期間發(fā)表文章150-151
• 附錄三 個人簡歷151

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 余增亮，霍裕平;離子注入生物學(xué)研究述評[J];安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;1994年03期

2 董喜存;李文建;何金玉;劉清芳;余麗霞;周利斌;曲穎;頡紅梅;;碳離子束對甜高梁輻射誘變的當(dāng)代效應(yīng)[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報;2007年06期

3 侯歲穩(wěn);吳大利;張穎聰;孫蘭弟;李文建;頡紅梅;梁凱;張彥萍;程曦;秦倩倩;賈瑞玲;;~(12)C~(6+)重離子輻照胡麻種子初步研究[J];輻射研究與輻射工藝學(xué)報;2008年02期

4 張秋英;余麗霞;李彥生;杜艷;李文建;劉曉冰;;重離子束輻照大豆籽粒當(dāng)代效應(yīng)的初步研究[J];大豆科學(xué);2013年05期

5 唐掌雄,劉志芳,施巾幗,孫國慶,衛(wèi)增泉,李文建,頡紅梅;重離子輻照冬小麥誘變效應(yīng)的研究[J];核技術(shù);2005年01期

6 侯歲穩(wěn);孫蘭弟;張穎聰;吳大利;管利萍;李文建;黨秉榮;頡紅梅;周利斌;高清祥;;~(12)C~(6+)重離子輻照油菜誘變效應(yīng)研究[J];核技術(shù);2008年06期

7 王浩翰;重離子對春小麥誘變育種及生物效應(yīng)的研究[J];核農(nóng)學(xué)報;2003年01期

8 羅紅兵;趙葵;周文新;倪媚楠;屠乃美;孔福全;;重離子輻射誘導(dǎo)玉米雄性不育突變系的遺傳研究[J];核農(nóng)學(xué)報;2008年03期

9 衛(wèi)增泉,頡紅梅,梁劍平,袁世斌,馮巖,謝忠奎;重離子束在誘變育種和分子改造中的應(yīng)用[J];原子核物理評論;2003年01期

10 周利斌;李文建;曲穎;李萍;;重離子束輻照育種研究進展及發(fā)展趨勢[J];原子核物理評論;2008年02期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 吳坤;小麥突變體研究和隱性抗白粉病基因pm2026的精細定位[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

2 聶小軍;基于高通量測序技術(shù)的小麥和紫莖澤蘭基因組學(xué)初步研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 何偉明;基于重測序數(shù)據(jù)的群體SNP位點檢測及基因型判斷[D];華南理工大學(xué);2013年

  本文關(guān)鍵詞：碳離子束輻照擬南芥突變體篩選及誘變效應(yīng)研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：488272