本文關(guān)鍵詞：Atg5蛋白調(diào)控晚期胞內(nèi)體和溶酶體的生成，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：細(xì)胞自噬是真核細(xì)胞一種依賴于溶酶體的降解途徑,當(dāng)細(xì)胞遇到各種形式的刺激時(shí),自吞噬將降解細(xì)胞自身大分子、細(xì)胞器和一些錯(cuò)誤折疊的蛋白以幫助細(xì)胞緩解應(yīng)激,自吞噬過(guò)程在進(jìn)化上高度保守。Atg5蛋白在自吞噬過(guò)程中起重要的作用,Atg5-Atg12結(jié)合系統(tǒng)在自噬體膜的彎曲并招募Atg8(LC3)上起重要作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)Atg5蛋白同時(shí)也在溶酶體和晚期胞內(nèi)體的形成過(guò)程中扮演重要的角色,而這一過(guò)程是非自吞噬依賴途徑。我們發(fā)現(xiàn),在Atg5基因缺失的細(xì)胞中,出現(xiàn)大量的溶酶體和晚期胞內(nèi)體融合形成的雜交體,這是由于從雜交體抽離晚期胞內(nèi)體成分的過(guò)程受到阻礙,進(jìn)而晚期胞內(nèi)體成分的再循環(huán)利用過(guò)程也被阻斷,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的雜交體大量滯留,溶酶體和晚期胞內(nèi)體不能進(jìn)行再生。我們同時(shí)在Atg7,Atg12,Atg9基因(自噬必需基因)缺失細(xì)胞中觀察晚期胞內(nèi)體和溶酶體,并不能觀察到與Atg5基因缺失的相同現(xiàn)象。晚期胞內(nèi)體從雜交體抽離這一過(guò)程是受環(huán)境中的酸堿度調(diào)控,而細(xì)胞中囊泡內(nèi)酸性的維持依賴于囊泡上招募的V-ATPase。我們的研究表明,V1-ATPase并不能有效被招募到酸性囊泡上,這直接導(dǎo)致雜交體p H升高,晚期胞內(nèi)體成分不能從雜交體順利抽離,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)雜交體的大量滯留。當(dāng)我們?cè)贏tg5基因缺失的細(xì)胞中人為降低細(xì)胞內(nèi)的p H值時(shí),受損的溶酶體和晚期胞內(nèi)體再生過(guò)程得到修復(fù),我們看到與WT細(xì)胞中類似的晚期胞內(nèi)體和溶酶體結(jié)構(gòu)。我們的研究闡明了Atg5除自吞噬外的其他作用,也即Atg5在溶酶體和晚期胞內(nèi)體再生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
【關(guān)鍵詞】：晚期胞內(nèi)體/溶酶體再生 Atg5 自吞噬
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q26
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 英文縮略詞對(duì)照表9-11
• 第1章 引言11-34
• 1.1 溶酶體、晚期胞內(nèi)體生成機(jī)制概述11-29
• 1.1.1 溶酶體概述11-12
• 1.1.2 胞內(nèi)體概述12
• 1.1.3 溶酶體功能12-16
• 1.1.4 溶酶體與疾病16-25
• 1.1.5 溶酶體、晚期胞內(nèi)體生成機(jī)制25-29
• 1.2 Atg蛋白的研究進(jìn)展29-34
• 1.2.1 Atg蛋白的分類29-33
• 1.2.2 Atg5蛋白的功能研究33-34
• 第2章 材料與方法34-51
• 2.1 試劑與抗體34-35
• 2.1.1 抗體34
• 2.1.2 試劑34-35
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)35-36
• 2.3 細(xì)胞電轉(zhuǎn)36
• 2.4 Lentivirus病毒構(gòu)建以及感染36-39
• 2.5 質(zhì)粒、Si RNA、Sh RNA信息39
• 2.6 活細(xì)胞成像39
• 2.7 細(xì)胞內(nèi)吞囊泡提取39-40
• 2.8 免疫熒光染色40-42
• 2.9 透射電鏡42
• 2.10 顯微鏡圖像分析42
• 2.11 蛋白免疫印跡42-44
• 2.12 RNA提純及反轉(zhuǎn)錄PCR44-46
• 2.13 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建46-48
• 2.14 單克隆穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建48-49
• 2.15 膽固醇含量檢測(cè)49-51
• 第3章 Atg5缺失導(dǎo)致晚期胞內(nèi)體和溶酶體再生缺陷51-59
• 3.1 本章引論51
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-58
• 3.2.1 Atg5~(-/-) MEF細(xì)胞LPOs大小、數(shù)量和分布發(fā)生改變51-53
• 3.2.2 導(dǎo)入外源Atg5至Atg5~(-/-) MEF細(xì)胞中LPOs大小、數(shù)量和分布恢復(fù)正常53-56
• 3.2.3 Atg5敲低的大鼠腎上皮細(xì)胞（ NRK）中LPOs數(shù)量、大小和分布改變56-58
• 3.3 本章討論與小結(jié)58-59
• 第4章 Atg5以非自吞噬依賴的方式調(diào)控晚期胞內(nèi)體和溶酶體再生59-68
• 4.1 本章引論59-60
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-67
• 4.2.1 Atg7穩(wěn)定敲低NRK細(xì)胞中晚期胞內(nèi)體與溶酶體數(shù)量、大小和分布未見明顯改變60-62
• 4.2.2 Atg9穩(wěn)定敲低NRK細(xì)胞中晚期胞內(nèi)體與溶酶體數(shù)量、大小和分布未見明顯改變62-64
• 4.2.3 Atg12穩(wěn)定敲低NRK細(xì)胞中晚期胞內(nèi)體與溶酶體數(shù)量、大小和分布未見明顯改變64-67
• 4.3 本章討論與小結(jié)67-68
• 第5章 Atg5缺失將導(dǎo)致晚期胞內(nèi)體和溶酶體再生停留在雜交體68-79
• 5.1 本章引論68-69
• 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果69-78
• 5.2.1 利用不同標(biāo)記物可以顯示W(wǎng)T MEF細(xì)胞中晚期胞內(nèi)體、溶酶體和雜交體69-72
• 5.2.2 在Atg5~(-/-) MEF細(xì)胞中缺少晚期胞內(nèi)體72-73
• 5.2.3 在Atg5~(-/-) MEF細(xì)胞中LPOs是晚期胞內(nèi)體 -溶酶體的雜交體73-78
• 5.3 本章討論與小結(jié)78-79
• 第6章 Atg5缺失導(dǎo)致晚期胞內(nèi)體長(zhǎng)管及長(zhǎng)管調(diào)節(jié)的分裂過(guò)程受損79-84
• 6.1 本章引論79
• 6.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-83
• 6.2.1 Atg5缺失導(dǎo)致晚期胞內(nèi)體長(zhǎng)管和長(zhǎng)管調(diào)控的分裂過(guò)程受損79-81
• 6.2.2 新生成的LPOs來(lái)源于晚期胞內(nèi)體 -溶酶體的雜交體81-82
• 6.2.3 新生成的LPOs可與早期胞內(nèi)體融合82-83
• 6.3 本章討論與小結(jié)83-84
• 第7章 Atg5缺失導(dǎo)致晚期胞內(nèi)體成分從雜交體中分離障礙84-88
• 7.1 本章引論84
• 7.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果84-87
• 7.2.1 SNX1在Atg5缺失細(xì)胞中形成增大的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)84-86
• 7.2.2 Atg5缺失導(dǎo)致由Retromer調(diào)控的晚期胞內(nèi)體成分從雜交體分離過(guò)程障礙86-87
• 7.3 本章討論與小結(jié)87-88
• 第8章 Atg5缺失導(dǎo)致雜交體膜上V1-ATPase定位障礙88-93
• 8.1 本章引論88-89
• 8.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果89-92
• 8.2.1 Atg5缺失導(dǎo)致V-ATPase V1招募到雜交體上數(shù)量減少89-90
• 8.2.2 降低LPOs上V-ATPase V1含量將導(dǎo)致LPOs再生異常90-92
• 8.3 本章討論與小結(jié)92-93
• 第9章 降低細(xì)胞內(nèi)pH將會(huì)修復(fù)受損的晚期胞內(nèi)體/溶酶體再生過(guò)程93-96
• 9.1 本章引論93
• 9.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果93-95
• 9.2.1 降低細(xì)胞內(nèi)p H將修復(fù)受損的晚期胞內(nèi)體 /溶酶體再生過(guò)程93-95
• 9.3 本章討論與小結(jié)95-96
• 第10章 Atg5缺失造成細(xì)胞中雜交體膽固醇含量降低96-101
• 10.1 本章引論96
• 10.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果96-100
• 10.2.1 Atg5缺失導(dǎo)致胞內(nèi)雜交體膽固醇含量降低96-97
• 10.2.2 降低WT MEF細(xì)胞中膽固醇含量影響LPOs的大小、數(shù)量和分布97-98
• 10.2.3 降低WT MEF細(xì)胞中膽固醇含量影響V1-ATPase分布情況98-100
• 10.3 本章討論與小結(jié)100-101
• 第11章 膽固醇可修復(fù)Atg5缺失細(xì)胞中V-ATPase定位和LPOs表型101-105
• 11.1 本章引論101
• 11.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果101-104
• 11.2.1 增加Atg5~(-/-) MEF細(xì)胞中膽固醇含量將修復(fù)LPOs的表型101-103
• 11.2.2 增加Atg5~(-/-) MEF細(xì)胞中膽固醇含量將修復(fù)V-ATPase的定位103-104
• 11.3 本章討論與小結(jié)104-105
• 第12章 討論與展望105-111
• 12.1 結(jié)論105-107
• 12.2 討論107-111
• 參考文獻(xiàn)111-118
• 致謝118-120
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果120

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 彭俊雅;Atg5蛋白調(diào)控晚期胞內(nèi)體和溶酶體的生成[D];清華大學(xué);2015年

  本文關(guān)鍵詞：Atg5蛋白調(diào)控晚期胞內(nèi)體和溶酶體的生成，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：450209