本文關(guān)鍵詞：Shewanella oneidensis脂肪酸生物合成及其調(diào)控的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：脂肪酸是細(xì)菌的細(xì)胞膜磷脂的重要組成部分,影響著細(xì)菌的生長(zhǎng)、代謝等幾乎所有的生命活動(dòng)。Shewanella脂肪酸的生物合成與其適應(yīng)其生境的能力直接相關(guān),但一直以來由于研究模式系統(tǒng)的缺乏而理解有限。Shewanella oneidensisMR-1(奧奈達(dá)希瓦氏菌)是該屬的代表菌株,是生理生化以及基因蛋白水平表達(dá)調(diào)控的研究模式菌。本研究首次就S. oneidensis的脂肪酸合成途徑(主要是不飽和脂肪酸合成途徑)及其表達(dá)調(diào)控進(jìn)行了深入分析和研究。適用于S. oneidensis的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和GFP報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建為課題所需,本研究首先構(gòu)建了一個(gè)能在S. oneidensis中廣泛應(yīng)用的IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)體系pHGE-Ptac,進(jìn)而又構(gòu)建了IPTG誘導(dǎo)的GFP報(bào)告系統(tǒng)pHGE-Ptac-GFP。這個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)體系為本研究的順利開展奠定了基礎(chǔ),在本研究的第三、四、五章都有應(yīng)用,目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于S. oneidensis的研究中。S. oneidensis FabR和FadR調(diào)控不飽和脂肪酸的有氧和無(wú)氧合成途徑基因組分析得出結(jié)論：與Escherichia coli(大腸桿菌,以下簡(jiǎn)稱E. coli)一樣,S. oneidensis含有編碼脂肪酸合成關(guān)鍵酶的所有基因。本論文實(shí)驗(yàn)表明,與E. coli不一樣的是,S. oneidensis不僅含有不飽和脂肪酸合成的無(wú)氧途徑(基于FabA),還含有一條不飽和脂肪酸合成的有氧途徑(基于DesA)。野生型中,基于FabA的無(wú)氧合成途徑處于主要地位,但FabA途徑的缺失會(huì)誘導(dǎo)DesA表達(dá)增力。S. oneidensis的調(diào)控蛋白FabR和FadR都調(diào)控不飽和脂肪酸合成的無(wú)氧和有氧途徑。FabR能結(jié)合到fabA和desA的啟動(dòng)子區(qū)域,直接抑制FabA和DesA的表達(dá)；FadR能結(jié)合到fabA啟動(dòng)子區(qū)域,直接激活FabA的表達(dá)但不直接調(diào)控DesA表達(dá)。S. oneidensis不飽和脂肪酸合成途徑的多樣性是其適應(yīng)不同外界環(huán)境的基礎(chǔ)。通過GC-MS分析各菌株中的脂肪酸成分和含量,本論文得出結(jié)論：FabA或FadR的缺失顯著影響細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量和成分,但兩者與野生型相比的差別并不一致�！鱢abA有氧條件下在LB中的生長(zhǎng)有微弱缺陷,△fadR的生長(zhǎng)缺陷則非常明顯,但兩者都能通過外源添加不飽和脂肪酸回復(fù)生長(zhǎng)。所以,FadR在S. oneidensis的不飽和脂肪酸調(diào)控以及細(xì)胞生長(zhǎng)中起到關(guān)鍵的作用。S. oneidensis FabB功能和表達(dá)調(diào)控特征的研究不飽和脂肪酸合成的無(wú)氧途徑中還有一個(gè)關(guān)鍵酶FabB。S. oneidensis AfabB在有氧條件下與△fadR一樣生長(zhǎng)緩慢。FabB的缺失導(dǎo)致C14的積累,C14不能進(jìn)一步合成C16。導(dǎo)致△fabB生長(zhǎng)缺陷的直接原因是C14不能充分延長(zhǎng)至C16�！鱢abB通過增加不飽和脂肪酸C14：1的含量從而增加膜的流動(dòng)性,△fadR則是通過增加支鏈脂肪酸iso/antiso-C15:0的含量而增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性。FabB的缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)缺陷,FabB的過表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。FabB的表達(dá)受FadR的調(diào)控但不受FabR的調(diào)控。雖然FabA缺失突變株中fabB的啟動(dòng)子活性下降,但是FabA表達(dá)量的增加并不能導(dǎo)致fabB啟動(dòng)子活性隨之增強(qiáng)。所以FadR對(duì)FabB表達(dá)的調(diào)控并不是通過直接調(diào)控FabA的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。因此,S. oneidensis FabB的功能及其表達(dá)調(diào)控與E.coli FabB有區(qū)別。S. oneidensis FabB對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響大于FabA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。△fabA△desA和△fabB△desA中的細(xì)胞色素c蛋白含量明顯比野生型少,并且△fabA△desA比△fabB△desA更少。另外,△fabB△desA雙敲除突變株菌落長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)出現(xiàn)的橘紅色小菌落取樣測(cè)細(xì)胞色素c蛋白含量,也發(fā)現(xiàn)其含量比△fabB△desA多。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果暗示不飽和脂肪酸對(duì)c型細(xì)胞色素的生物合成有作用。S.oneidensis △fadR表型的相關(guān)研究當(dāng)△fadR在M1基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),外源添加油酸不能回復(fù)它的生長(zhǎng)缺陷�！鱢adR在M1培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)缺陷表型是多個(gè)基因共同作用的結(jié)果,僅僅分析含有FadR結(jié)合位點(diǎn)的基因并不能揭示△fadR表型的真正原因。外源添加異亮氨酸能夠使△fadR回復(fù)其在M1培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)缺陷。在△fadR中引入△prpB和△prpF能使其在M1培養(yǎng)基中回復(fù)部分生長(zhǎng)。將PrpC在△fadR中過表達(dá)之后,△fadR的生長(zhǎng)缺陷得到回復(fù),且能回復(fù)到與野生型基本一致。這表明S. oneidensis △fadR的生長(zhǎng)缺陷表型與支鏈氨基酸和甲基檸檬酸循環(huán)途徑有一定的聯(lián)系,但具體機(jī)制如何,還有待進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：S.oneidensis 不飽和脂肪酸合成途徑 支鏈脂肪酸 調(diào)控蛋白FabR/FadR 生長(zhǎng)缺陷 支鏈氨基酸 甲基檸檬酸循環(huán)
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q936
【目錄】：

• 致謝6-10
• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 緒論15-34
• 1.1 Ⅱ型脂肪酸合成途徑(FAS Ⅱ)15-23
• 1.1.1 Ⅱ型脂肪酸合成途徑(FAS Ⅱ)概述16-19
• 1.1.2 Ⅱ型脂肪酸合成途徑(FAS Ⅱ)的功能酶19-21
• 1.1.3 Ⅱ型脂肪酸合成途徑(FAS Ⅱ)的產(chǎn)物及其功能21-23
• 1.2 支鏈脂肪酸的合成途徑23-24
• 1.3 不飽和脂肪酸的合成途徑24-27
• 1.3.1 不飽和脂肪酸的無(wú)氧合成途徑24-25
• 1.3.2 不飽和脂肪酸的有氧合成途徑25-27
• 1.3.3 多不飽和脂肪酸的合成途徑27
• 1.4 細(xì)菌脂肪酸合成的調(diào)控27-32
• 1.4.1 細(xì)菌脂肪酸合成的調(diào)控蛋白28
• 1.4.2 E.coli中FadR調(diào)控脂肪酸的合成和降解28-30
• 1.4.3 E.coli中FabR調(diào)控不飽和脂肪酸的合成30-31
• 1.4.4 P.aeruginosa中Δ9酰基去飽和酶的調(diào)控31
• 1.4.5 革蘭氏陽(yáng)性菌中脂肪酸合成的調(diào)控31-32
• 1.5 脂肪酸合成途徑在S.oneidensis中的研究背景和立項(xiàng)依據(jù)32-34
• 2 S.oneidensis中IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)和GFP報(bào)告系統(tǒng)的構(gòu)建34-47
• 2.1 材料與方法35-39
• 2.1.1 供試菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞培養(yǎng)條件35-37
• 2.1.2 構(gòu)建IPTG誘導(dǎo)表達(dá)體系37-38
• 2.1.3 構(gòu)建和表達(dá)GFP融合蛋白38
• 2.1.4 點(diǎn)突變38
• 2.1.5 熒光共聚焦顯微鏡分析38
• 2.1.6 蛋白表達(dá)分析38-39
• 2.1.7 生物信息學(xué)和數(shù)據(jù)分析39
• 2.2 結(jié)果與分析39-46
• 2.2.1 適用于S.oneidensis研究的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)體系的構(gòu)建39-40
• 2.2.2 適用于S.oneidensis研究的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)體系的驗(yàn)證40-42
• 2.2.3 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)GFP融合蛋白體系的構(gòu)建和驗(yàn)證42-46
• 2.3 討論46-47
• 3 S.oneidensis FabR和FadR調(diào)控不飽和脂肪酸的有氧和無(wú)氧合成途徑47-68
• 3.1 材料與方法48-55
• 3.1.1 供試菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞培養(yǎng)條件48-49
• 3.1.2 突變株和回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建49-51
• 3.1.3 基因表達(dá)分析51-52
• 3.1.4 脂肪酸含量和成分的測(cè)定52-53
• 3.1.5 細(xì)菌單雜交試驗(yàn)53-54
• 3.1.6 S.oneidensis FadR的表達(dá)和純化54
• 3.1.7 凝膠阻滯分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay)54-55
• 3.1.8 生物信息學(xué)分析55
• 3.2 結(jié)果與分析55-65
• 3.2.1 S.oneidensis含有不飽和脂肪酸合成的無(wú)氧和有氧兩條途徑55-58
• 3.2.2 S.oneidensis FabR和FadR調(diào)控不飽和脂肪酸合成的無(wú)氧和有氧途徑58-59
• 3.2.3 S.oneidensis中FabA或FadR的缺失顯著影響細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的含量和成分59-60
• 3.2.4 S.oneidensis中不飽和脂肪酸無(wú)氧合成途徑的缺失誘導(dǎo)desA基因表達(dá)增加60-62
• 3.2.6 S.oneidensis中FadR直接調(diào)控FabA但不直接調(diào)控DesA62-64
• 3.2.7 S.oneidensis的FabR直接抑制fabA和desA基因轉(zhuǎn)錄64-65
• 3.3 討論65-68
• 4 S.oneidensis FabB功能和表達(dá)調(diào)控特征的研究68-80
• 4.1 材料與方法69-71
• 4.1.1 供試菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞培養(yǎng)條件69-70
• 4.1.2 突變株和回補(bǔ)質(zhì)粒的構(gòu)建70
• 4.1.3 基因表達(dá)分析70
• 4.1.4 脂肪酸含量和成分的測(cè)定70
• 4.1.5 細(xì)胞色素c蛋白染色實(shí)驗(yàn)70-71
• 4.1.6 生物信息學(xué)分析71
• 4.2 結(jié)果與分析71-78
• 4.2.1 S.oneidens fabB(S03072)缺失突變株表型分析71-74
• 4.2.2 S.oneidensis FabB過表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞死亡74-75
• 4.2.3 FadR調(diào)控fabB的轉(zhuǎn)錄但FabR不調(diào)控fabB的轉(zhuǎn)錄75-77
• 4.2.4 FadR對(duì)FabB表達(dá)的調(diào)控并不是通過直接調(diào)控FabA的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的77-78
• 4.3 討論78-80
• 5 S.oneidensis ΔfadR表型的相關(guān)研究80-92
• 5.1 材料和方法81-83
• 5.1.1 供試菌株、質(zhì)粒及細(xì)胞培養(yǎng)條件81
• 5.1.2 突變株和質(zhì)粒的構(gòu)建81-82
• 5.1.3 基因表達(dá)分析82
• 5.1.4 脂肪酸含量和成分的測(cè)定82-83
• 5.1.5 轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變及隨機(jī)引物鑒定83
• 5.1.6 生物信息學(xué)分析83
• 5.2 結(jié)果和分析83-90
• 5.2.1 基本培養(yǎng)基M1中添加油酸不能回復(fù)S.oneidensis ΔfadR的生長(zhǎng)缺陷83-85
• 5.2.2 M1中添加異亮氨酸能回復(fù)S.oneidensis ΔfadR的生長(zhǎng)缺陷85-87
• 5.2.3 利用轉(zhuǎn)座子技術(shù)篩選在M1中ΔfadR生長(zhǎng)部分回復(fù)的突變株87-90
• 5.3 討論90-92
• 6 論文總結(jié)92-95
• 6.1 主要研究結(jié)論92-93
• 6.2 創(chuàng)新之處93-94
• 6.3 不足之處及未來研究方向展望94-95
• 參考文獻(xiàn)95-113
• 附件：攻讀博士學(xué)位期間的主要成果113

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  本文關(guān)鍵詞：Shewanella oneidensis脂肪酸生物合成及其調(diào)控的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：441576