本文關(guān)鍵詞：Npu DnaE intein的結(jié)構(gòu)與機(jī)理研究和蛋白質(zhì)雙模式成像探針的制備及應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本文分別從結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能應(yīng)用的角度對兩種蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究。內(nèi)容主要分為兩個部分：(1)念珠藻Npu DnaE intein的結(jié)構(gòu)解析和剪接機(jī)理研究。已報道的所有分裂型intein的結(jié)構(gòu)均是順式結(jié)構(gòu),無法提供內(nèi)含肽準(zhǔn)確的信息。我們通過蛋白質(zhì)共表達(dá)的方法制備了Npu DnaE intein的天然復(fù)合物,并且解析了第一個分裂型intein的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析和蛋白質(zhì)突變體的功能研究,發(fā)現(xiàn)了NArgg50和cSer35兩個氨基酸殘基在Npu DnaE intein的反式剪接過程中所發(fā)揮的重要作用。(2)GFP36+ -dLBT融合蛋白在熒光和磁共振成像中的應(yīng)用。我們利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)制備了GFP36+ -dLBT融合蛋白探針,同時鑒定了此探針在體外、細(xì)胞內(nèi)和小鼠體內(nèi)的熒光和磁共振成像效果。結(jié)果表明GFP36+ -dLBT融合蛋白不僅保留了兩個成像模體的優(yōu)良特性,還能夠通過實體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(enhanced permeability and retention effect, EPR)被動靶向腫瘤組織進(jìn)行熒光和磁共振雙成像。第一章是對蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的簡介和綜述,介紹了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和剪接機(jī)理。第一節(jié)主要包括蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)、分布、命名和分類,第二節(jié)闡述了內(nèi)含肽的一級到三級結(jié)構(gòu),第三節(jié)概括了三類內(nèi)含肽的剪接機(jī)理,第四節(jié)總結(jié)了內(nèi)含肽的應(yīng)用。第二章是Npu DnaE intein的結(jié)構(gòu)和剪接機(jī)理研究。我們設(shè)計了一個含有兩個核糖體結(jié)合位點的蛋白質(zhì)表達(dá)體系,成功地制備了具有天然的分裂結(jié)構(gòu)的NpuDnaE intein復(fù)合物,解析了首個分裂型intein的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),除了已報道的靜電相互作用外,我們發(fā)現(xiàn)疏水相互作用也是intein相互識別的主要驅(qū)動力之一。反式結(jié)構(gòu)顯示NArg50和CSer35位于剪接活性中心,能與催化活性氨基酸形成氫鍵從而促進(jìn)蛋白質(zhì)剪接。同時發(fā)現(xiàn),Npu DnaE intein的最后一個氨基酸cAsn36具有獨特的側(cè)鏈構(gòu)象,它在晶體結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)出的兩種空間取向能夠分別與Nrgg50和CSer35形成氫鍵。體外的剪接實驗證明,任何一個氨基酸的突變都會導(dǎo)致intein剪接活性的下降,而兩個氨基酸的同時突變則會更大程度地抑制剪接速率。此外,NArg50還能和位于N端剪接活性位點的CAsp17形成氫鍵,從而影響第一步的N-S�；D(zhuǎn)移過程。體外剪切實驗證明NArg50突變會導(dǎo)致剪切副產(chǎn)物增多以及剪接效率的下降。綜上所述,在Npu DnaE intein的剪接過程中,位于非保守區(qū)的NArg50不僅參與了Asn的環(huán)化過程,提高了反式剪接的速率；還有效地避免了N端剪切副反應(yīng)的發(fā)生,保證了反式剪接的效率。第三章是生物成像的概述和研究進(jìn)展介紹。第一節(jié)概括總結(jié)了幾種常見的生物成像手段,并對各種方法的優(yōu)缺點分別進(jìn)行了比較。第二節(jié)介紹了熒光和磁共振雙成像探針的研究進(jìn)展。第四章是GFP36+ -dLBT融合蛋白的制備和功能研究。我們通過蛋白質(zhì)重組和表達(dá)純化技術(shù)制備了GFP36+ -dLBT融合蛋白。體外實驗證明GFP36+ -dLBT融合蛋白既保持了GFP的熒光成像特性,又保持了dLBT的磁共振成像性質(zhì)。同時,由于GFP36+表面帶有很多正電荷,也賦予了GFP36+ -dLBT融合蛋白穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞的能力。小鼠的體內(nèi)成像結(jié)果表明,GFP36+ -dLBT融合蛋白作為一個生物大分子,能夠通過EPR效應(yīng)被動靶向腫瘤組織,從而實現(xiàn)小鼠腫瘤特異性的熒光和磁共振雙成像。因此,我們通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)簡單高效制備熒光磁共振雙成像探針的方法,為今后多功能成像探針的制備提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：分裂型蛋白質(zhì)內(nèi)含肽 反式結(jié)構(gòu) Asn環(huán)化 剪接機(jī)理 融合蛋白 熒光成像 磁共振成像
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q51
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 第一部分 Npu DnaE intein的結(jié)構(gòu)和剪接機(jī)理研究13-91
• 第1章 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽簡介13-43
• 1.1 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽概述13-16
• 1.1.1 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的發(fā)現(xiàn)13
• 1.1.2 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的分布13-14
• 1.1.3 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的命名14-15
• 1.1.4 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的分類15-16
• 1.2 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽結(jié)構(gòu)16-19
• 1.2.1 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的氨基酸殘基編號法則16-17
• 1.2.2 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的一級結(jié)構(gòu)17-18
• 1.2.3 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的高級結(jié)構(gòu)18-19
• 1.3 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽剪接反應(yīng)機(jī)理19-25
• 1.3.1 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的順式剪接機(jī)理20-21
• 1.3.2 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的反式剪接機(jī)理21-22
• 1.3.3 其他蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的剪接機(jī)理22-25
• 1.4 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽應(yīng)用25-32
• 1.4.1 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)純化25-27
• 1.4.2 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)骨架環(huán)化27-28
• 1.4.3 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)標(biāo)記28-30
• 1.4.4 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽介導(dǎo)蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記30-31
• 1.4.5 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽介導(dǎo)合成特殊蛋白質(zhì)31
• 1.4.6 蛋白質(zhì)內(nèi)含肽作為分子開關(guān)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的功能31-32
• 1.4.7 依賴于蛋白質(zhì)內(nèi)含肽的生物傳感器32
• 1.5 小結(jié)32-33
• 1.6 本文的研究內(nèi)容和意義33-34
• 參考文獻(xiàn)34-43
• 第2章 念珠藻Npu PCC73102 DnaE split intein結(jié)構(gòu)和功能研究43-91
• 2.1 引言43-44
• 2.2 實驗材料與方法44-60
• 2.2.1 實驗材料44-46
• 2.2.2 Npu intein共表達(dá)蛋白復(fù)合物的制備46-51
• 2.2.3 Npu intein復(fù)合物的核磁共振譜圖51-52
• 2.2.4 Npu intein復(fù)合物的晶體制備和解析52-55
• 2.2.5 剪接和剪切實驗蛋白樣品制備55-59
• 2.2.6 Npu~N和Npu~C相互作用實驗59-60
• 2.2.7 蛋白質(zhì)剪接和剪切實驗60
• 2.3 結(jié)果與討論60-85
• 2.3.1 Npu DnaE split intein復(fù)合物結(jié)核磁共振結(jié)構(gòu)61-65
• 2.3.2 Npu DnaE split intein復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)65-67
• 2.3.3 Npu DnaE split intein相互作用機(jī)理67-75
• 2.3.4 保守氨基酸殘基對蛋白質(zhì)剪接的影響75-85
• 2.4 本章總結(jié)85-86
• 參考文獻(xiàn)86-91
• 第二部分 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白雙模態(tài)成像體系的研究91-133
• 第3章 生物成像簡介91-109
• 3.1 生物成像概述91-97
• 3.1.1 引言91
• 3.1.2 分子成像方法91-97
• 3.2 雙模態(tài)成像體系97-100
• 3.2.1 引言97
• 3.2.2 釓離子螯合物-有機(jī)熒光基團(tuán)小分子雙成像系統(tǒng)97-98
• 3.2.3 釓離子螯合物-無機(jī)納米粒子雙成像系統(tǒng)98-99
• 3.2.4 釓離子螯合物-樹枝狀大分子雙成像系統(tǒng)99
• 3.2.5 磁共振造影劑-量子點雙成像系統(tǒng)99
• 3.2.6 磁性納米粒子-熒光雙成像系統(tǒng)99-100
• 3.3 本文研究內(nèi)容及意義100-102
• 參考文獻(xiàn)102-109
• 第4章 GFP~(36+)-dLBT雙成像蛋白探針的制備及功能研究109-133
• 4.1 引言109-110
• 4.2 實驗材料與方法110-116
• 4.2.1 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白制備110-114
• 4.2.2 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白特異性結(jié)合釓離子114
• 4.2.3 熒光光譜鑒定GFP~(36+)-dLBT融合蛋白114
• 4.2.4 紫外光譜鑒定GFP~(36+)-dLBT融合蛋白114
• 4.2.5 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白體外MRI信號測試114
• 4.2.6 GFP~(36+)-1L-dLBT融合蛋白體外MRI信號測試114
• 4.2.7 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白體外弛豫效能測試114-115
• 4.2.8 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白癌細(xì)胞內(nèi)的熒光成像115
• 4.2.9 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白癌細(xì)胞內(nèi)的磁共振成像115
• 4.2.10 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白在荷人瘤裸鼠模型的熒光成像115
• 4.2.11 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白在荷人瘤裸鼠模型的磁共振成像115-116
• 4.2.12 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白在荷人瘤裸鼠模型各器官的熒光成像116
• 4.3 結(jié)果與討論116-127
• 4.3.1 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白制備和鑒定116-117
• 4.3.2 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白體外性質(zhì)鑒定117-121
• 4.3.3 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白細(xì)胞水平性質(zhì)鑒定121-123
• 4.3.4 GFP~(36+)-dLBT融合蛋白體內(nèi)性質(zhì)鑒定123-127
• 4.4 小結(jié)127-129
• 參考文獻(xiàn)129-133
• 附錄一 主要溶液配制133-135
• 附錄二 常用實驗技術(shù)135-143
• 致謝143-145
• 在讀期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與取得的研究成果145
• 已發(fā)表論文145
• 申請中國發(fā)明專利145
• 待發(fā)表論文145

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1 王璋瑜;;蛋白設(shè)計實驗室公司買下融合蛋白技術(shù)實用權(quán)[J];生物技術(shù)通報;1990年10期

2 張毅,屈賢銘,楊勝利;融合蛋白基因工程應(yīng)用及研究[J];生物工程進(jìn)展;2000年03期

3 楊林,李國清,黃葆英,王全忠,龍綮新,王s閼，

本文編號：409194