本文關(guān)鍵詞：布魯氏菌二元調(diào)控系統(tǒng)TceSR和TcfSR的生物學(xué)功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯氏菌病是由感染人和動(dòng)物的布魯氏菌造成的對社會(huì)安全有嚴(yán)重危害的疾病,在世界上廣泛流行,尤其是在發(fā)展中國家,造成更為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌是一類兼性胞內(nèi)寄生菌,其毒力主要依賴于在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖的能力。二元調(diào)控系統(tǒng)(two-component regulatory system,TCS)能夠?qū)Νh(huán)境信號(hào)感受應(yīng)答、傳遞以及處理的信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)和控制。布魯氏菌有15對TCS,已有研究表明,位于染色體I的TCS與布魯氏菌的毒力密切相關(guān),但位于染色體II的TCS的毒力表型及其調(diào)控機(jī)制還尚不清楚。本研究以布魯氏菌TCS TceSR和TcfSR為研究對象,通過探討TCS TceSR和TcfSR對布魯氏菌毒力表型、相關(guān)基因表達(dá)和胞內(nèi)生存繁殖的影響,及其在小鼠體內(nèi)的毒力和免疫保護(hù)力,為揭示布魯氏菌感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制提供線索,也為新疫苗的研發(fā)、相關(guān)疫病的預(yù)防、控制和抗病育種工作提供依據(jù)。目的:本研究以羊種布魯氏菌參考株16M為研究對象,探討TCS TceSR和TcfSR的功能及其在布魯氏菌致病過程中的作用機(jī)制。(1)構(gòu)建TCS TceSR和TcfSR啟動(dòng)子失活的突變株,并對其進(jìn)行鑒定。(2)分析TCS TceSR和TcfSR突變株相關(guān)毒力基因的胞內(nèi)外轉(zhuǎn)錄水平,比較突變株和親本株毒力基因表達(dá)的差異,根據(jù)差異基因的功能及其在突變株中的轉(zhuǎn)錄變化,解釋突變株相關(guān)毒力表型的變化。(3)分析比較突變株和親本株胞內(nèi)生存相關(guān)表型的差異,確定TCS TceSR和TcfSR對布魯氏菌胞內(nèi)存活的作用。(4)分析突變株在小鼠體內(nèi)的毒力,探討TCS TceSR和TcfSR對布魯氏菌在小鼠體內(nèi)建立慢性感染的作用。方法:(1)利用同源重組和抗性替換的方法,構(gòu)建了TCS TceSR和TcfSR啟動(dòng)子失活的突變株;對獲得的基因突變株進(jìn)行PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性檢測。(2)布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞RAW264.7,qRT-PCR檢測布魯氏菌相關(guān)毒力基因(主要包括脂多糖合成相關(guān)蛋白、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、鞭毛系統(tǒng)、調(diào)控系統(tǒng)、壓力蛋白/泛素相關(guān)蛋白、氮源代謝分子)的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平;親本株和突變株在體外刺激環(huán)境中培養(yǎng)30min。利用qRT-PCR分析毒力基因omp25、virB1、vjbR、gntR、dnaK、Hfq、htrA的轉(zhuǎn)錄變化。(3)比較突變株和親本株的胞內(nèi)存活相關(guān)表型。布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,在侵染后不同時(shí)間,檢測細(xì)菌的黏附侵襲能力和胞內(nèi)存活能力;親本株和突變株侵染巨噬細(xì)胞RAW264.7,利用熒光定量PCR、流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡測定宿主細(xì)胞在細(xì)菌的侵襲下所引起的凋亡和自噬水平;構(gòu)建能夠表達(dá)綠色熒光的布魯氏菌,侵染巨噬細(xì)胞RAW264.7,觀察布魯氏菌與溶酶體的融合情況。(4)用布魯氏菌疫苗株和突變株分別腹腔接種免疫(106CFU)SPF級4-6周齡雌性BALB/c小鼠;接種后的不同時(shí)間點(diǎn)采集免疫小鼠血清,采用間接ELISA測定小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ的水平和總的IgG水平;無菌分離脾臟,測定脾臟載菌量,制備病理切片,檢測突變株的毒力;用105CFU的16M進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn),檢測各菌株的保護(hù)力;克隆、表達(dá)、純化TCES和TCFS兩個(gè)蛋白,以純化的蛋白作為抗原,分別對突變株免疫小鼠的血清進(jìn)行Western Blot分析。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建了TCS TceSR和TcfSR啟動(dòng)子突變株16MΔTceSR和16MΔTcfSR,在15代內(nèi)遺傳性穩(wěn)定;突變株和親本株的體外生長趨勢一致;體外刺激結(jié)果顯示,突變株對酸、堿、高鹽、熱應(yīng)激、營養(yǎng)缺陷和干燥的抵抗力降低。(2)親本株和突變株侵染細(xì)胞24h后,66個(gè)布魯氏菌相關(guān)毒力基因在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化,其中在16MΔTceSR突變株中,41個(gè)(62.12%)基因高表達(dá),25個(gè)(37.88%)基因低表達(dá);在16MΔTcfSR突變株中,47個(gè)(71.21%)基因高表達(dá),19(28.79%)個(gè)基因低表達(dá);在體外刺激環(huán)境下,布魯氏菌胞內(nèi)存活相關(guān)的基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平均低于在親本株中的轉(zhuǎn)錄水平。(3)突變株對細(xì)胞的粘附能力和胞內(nèi)存活能力是減弱的;細(xì)胞凋亡研究發(fā)現(xiàn),突變株與親本株引起宿主細(xì)胞凋亡程度相似;而細(xì)胞自噬結(jié)果卻發(fā)現(xiàn),突變株引起細(xì)胞自噬水平低于親本株;溶酶體融合實(shí)驗(yàn)顯示,侵染細(xì)胞24h時(shí)突變株組胞內(nèi)的布氏小體與溶酶體融合率高于親本株組。(4)突變株免疫小鼠后,可誘導(dǎo)機(jī)體分泌IFN-γ和IgG,小鼠脾臟載菌量低于親本株,但仍存在一定的毒力;攻毒后,突變株免疫的小鼠對親本株可產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力;布魯氏菌重組蛋白TCES和TCFS可以作為診斷抗原,鑒別突變株免疫和親本株免疫的小鼠。結(jié)論:(1)TCS TceSR和TcfSR在布魯氏菌抵抗逆環(huán)境中有重要的作用。(2)TCS TceSR和TcfSR突變株侵染宿主細(xì)胞后,66個(gè)毒力基因的表達(dá)受到了影響,使布魯氏菌適應(yīng)胞內(nèi)的各種不利環(huán)境,以利于布魯氏菌的胞內(nèi)存活。(3)TCS TceSR和TcfSR突變株在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫,其毒力比親本株下降明顯,但需進(jìn)一步改造。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 TCS TceSR和TcfSR 胞內(nèi)存活 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 免疫
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.61
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文縮略詞表14-16
• 引言16-17
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述 布魯氏菌分子致病機(jī)制的研究進(jìn)展17-41
• 1 布魯氏菌病概述17-20
• 1.1 布魯氏菌的種屬特性17-18
• 1.2 布魯氏菌病18-20
• 2 布魯氏菌毒力的研究現(xiàn)狀20-22
• 2.1 布魯氏菌的基本生物學(xué)性狀20
• 2.2 布魯氏菌的基因組學(xué)研究20-21
• 2.3 布魯氏菌的毒力因子21-22
• 3 布魯氏菌的毒力調(diào)控系統(tǒng)22-28
• 3.1 二元調(diào)控系統(tǒng)22-23
• 3.2 Ⅳ型分泌系統(tǒng)23-25
• 3.3 密度感應(yīng)系統(tǒng)25-26
• 3.4 磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)26-27
• 3.5 小調(diào)控RNA和熱休克蛋白27-28
• 4 布魯氏菌胞內(nèi)生存機(jī)制的研究28-39
• 4.1 布魯氏菌可在不同宿主細(xì)胞中生存28-30
• 4.2 不同狀態(tài)的布魯氏菌的胞內(nèi)生存30-32
• 4.3 布魯氏菌對胞內(nèi)生存環(huán)境的生理適應(yīng)32-33
• 4.4 布魯氏菌的胞內(nèi)生存與宿主細(xì)胞凋亡的關(guān)系33
• 4.5 布魯氏菌的胞內(nèi)生存與宿主細(xì)胞自噬的關(guān)系33-35
• 4.6 布魯氏菌的胞內(nèi)生存與宿主細(xì)胞溶酶體融合的關(guān)系35-36
• 4.7 布魯氏菌在胞內(nèi)生存過程中對宿主免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)36-39
• 5 本研究的目的和意義39-41
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究41-129
• 實(shí)驗(yàn)一 TCS TceSR和TcfSR突變株的構(gòu)建及鑒定41-63
• 摘要41
• 1 材料與方法41-50
• 1.1 材料41-42
• 1.2 方法42-50
• 2 結(jié)果50-60
• 2.1 目的基因N端與C端的擴(kuò)增50-52
• 2.2 Kan抗性基因的擴(kuò)增52
• 2.3 同源重組序列的融合52
• 2.4 突變株突變載體的構(gòu)建52-53
• 2.5 突變株的篩選與鑒定53-56
• 2.6 缺失株 16MΔTceSR和 16MΔTcfSR的遺傳穩(wěn)定性檢測56-57
• 2.7 生長曲線57-58
• 2.8 布魯氏菌在體外應(yīng)激條件下的生存能力58
• 2.9 體外刺激環(huán)境下的長期生存實(shí)驗(yàn)58-60
• 2.10布魯氏菌的聚集現(xiàn)象60
• 3 討論60-62
• 3.1 布魯氏菌TCS TceSR和TcfSR的選擇60-61
• 3.2 以T載體為自殺載體快速構(gòu)建布魯氏菌突變株61
• 3.3 布魯氏菌電轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化61-62
• 3.4 TCS TceSR和TcfSR失活后對布魯氏菌生長特性的影響62
• 3.5 TCS TceSR和TcfSR調(diào)控布魯氏菌抵抗外界環(huán)境的刺激62
• 4 小結(jié)62-63
• 實(shí)驗(yàn)二 TCS TceSR和TcfSR功能失活后相關(guān)毒力基因表達(dá)分析63-89
• 摘要63-64
• 1 材料與方法64-69
• 1.1 材料64-67
• 1.2 方法67-69
• 2 結(jié)果69-85
• 2.1 引物的特異性分析69-70
• 2.2 胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄最佳侵染時(shí)間的確定70
• 2.3 差異基因表達(dá)分析70-81
• 2.4 體外刺激條件下目的基因的相對表達(dá)分析81-84
• 2.5 細(xì)菌在不同生長時(shí)期TCS TceSR和TcfSR對virB1和vjbR的調(diào)控作用84-85
• 3 討論85-88
• 3.1 TceSR和TcfSR的胞內(nèi)高效表達(dá)時(shí)間85
• 3.2 TCS TceSR和TcfSR功能缺失后相關(guān)毒力基因的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平分析85
• 3.3 TCS TceSR和TcfSR功能缺失后胞內(nèi)存活相關(guān)毒力基因的體外轉(zhuǎn)錄分析85-87
• 3.4 TCS TceSR和TcfSR與virB1和vjbR的調(diào)控關(guān)系87-88
• 4 小結(jié)88-89
• 實(shí)驗(yàn)三 TCS TceSR和TcfSR對布魯氏菌胞內(nèi)生存的影響89-109
• 摘要89
• 1 材料與方法89-94
• 1.1 材料90-91
• 1.2 方法91-94
• 2 結(jié)果94-105
• 2.1 布魯氏菌對巨噬細(xì)胞的粘附侵襲能力94-95
• 2.2 布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活能力95-96
• 2.3 16MΔTceSR和 16MΔTcfSR不誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡96-101
• 2.4 16MΔTceSR和16MΔTcfSR誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生不同水平的自噬101-104
• 2.5 16MΔTceSR和 16MΔTcfSR可促進(jìn)溶酶體的融合104-105
• 3 討論105-107
• 3.1 TCS TceSR和TcfSR對巨噬細(xì)胞的粘附侵襲能力的影響105
• 3.2 TCS TceSR和TcfSR對巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力的影響105-106
• 3.3 TCS TceSR和TcfSR對宿主細(xì)胞凋亡的影響106-107
• 3.4 TCS TceSR和TcfSR對宿主細(xì)胞自噬的影響107
• 3.5 TCS TceSR和TcfSR對胞內(nèi)布魯氏菌與溶酶體融合的影響107
• 4 小結(jié)107-109
• 實(shí)驗(yàn)四 TCS TceSR和TcfSR突變株的小鼠體內(nèi)毒力分析及其對免疫的影響109-129
• 摘要109
• 1 材料與方法109-116
• 1.1 材料109-111
• 1.2 方法111-116
• 2 結(jié)果116-127
• 2.1 細(xì)胞免疫116-117
• 2.2 體液免疫117-118
• 2.3 小鼠脾臟CFU計(jì)數(shù)檢測突變株的毒力118-119
• 2.4 組織病理學(xué)變化119-121
• 2.5 突變株的免疫保護(hù)作用121-122
• 2.6 Tces基因和Tcfs基因的擴(kuò)增122-123
• 2.7 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定123-124
• 2.8 TCES和TCFS重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)124-125
• 2.9 TCES和TCFS重組蛋白表達(dá)形式的確定125-126
• 2.10 TCES和TCFS重組蛋白的純化126-127
• 2.11 Western Blot分析127
• 3 討論127-128
• 3.1 細(xì)胞免疫水平分析127
• 3.2 體液免疫水平分析127-128
• 3.3 突變株的毒力和保護(hù)力分析128
• 3.4 診斷抗原的反應(yīng)原性分析128
• 4 小結(jié)128-129
• 第三部分 全文總結(jié)129-131
• 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)131-132
• 參考文獻(xiàn)132-155
• 附錄一155-161
• 附錄二161-175
• 致謝175-177
• 作者簡介177-179
• 導(dǎo)師評閱表179

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 白耀霞;楊毅;王玉飛;王同坤;于爽;陳燕芬;付思美;黃留玉;田晉紅;陳澤良;;利用T載體克隆快速構(gòu)建布魯氏菌缺失突變株[J];中國生物工程雜志;2010年09期

2 付思美;白耀霞;曲R，

本文編號(hào)：404753