本文關(guān)鍵詞：水稻OsLIR1維持葉綠體功能的機(jī)制及OsEXPB2參與水稻根系發(fā)育的功能研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：水稻是單子葉植物的模式植物,同時(shí)也是世界上最重要的糧食作物之一。本文主要研究水稻OsLIR1維持葉綠體功能的機(jī)制及OsEXPB2在水稻根系發(fā)育中的作用。葉綠體是植物完成光合作用的主要場所,在類囊體膜系統(tǒng)中,捕光復(fù)合體結(jié)合葉綠素分子,形成色素-蛋白復(fù)合體,參與光能捕獲,形成ATP形式的能量。當(dāng)植物進(jìn)入衰老階段,捕光復(fù)合體和色素分子分離,葉綠體降解,葉片變黃,進(jìn)而營養(yǎng)物質(zhì)從老葉向新葉和種子轉(zhuǎn)移。葉片早衰是植株提前進(jìn)入衰老階段的表現(xiàn),嚴(yán)重影響植物的光合作用和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn),從而導(dǎo)致植株的生長受阻。因此,研究水稻光誘導(dǎo)基因維持葉綠體穩(wěn)定性的機(jī)理對(duì)進(jìn)一步了解水稻葉綠體功能具有重要理論意義,同時(shí)也可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提供有應(yīng)用價(jià)值的候選育種基因。OsLIR1,是一個(gè)光誘導(dǎo)基因,編碼含有128個(gè)氨基酸的蛋白,蛋白分子量為13.317 kDa。本文通過RNA干擾技術(shù)和蛋白互作分析對(duì)該基因的功能進(jìn)行了系統(tǒng)性研究,主要結(jié)論如下:①OsLIR1編碼的蛋白定位于葉綠體中,且可能是一個(gè)類囊體腔蛋白構(gòu)建了35S::OsLIR1-GFP融合表達(dá)載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草原生質(zhì)體,激光共聚焦顯微鏡觀察瞬時(shí)表達(dá)綠色熒光的原生質(zhì)體,結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsLIR1定位于葉綠體中。通過植物質(zhì)體數(shù)據(jù)庫(PPDB)在線分析,發(fā)現(xiàn)OsLIR1和擬南芥光調(diào)蛋白AT3g26740.1的蛋白序列同源性高達(dá)59%,而該蛋白是一個(gè)類囊體腔蛋白。同時(shí),使用ChloroP和TMHMM server 2.0在線軟件預(yù)測(cè)OsLIR1蛋白不是一個(gè)跨膜蛋白,并且N端含有35 aa的葉綠體信號(hào)肽(cTP),因此推測(cè)OsLIR1可能是一個(gè)類囊體腔蛋白。進(jìn)一步通過String在線軟件預(yù)測(cè)OsLIR1蛋白的互作網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)OsLIR1和多個(gè)含有脅迫響應(yīng)結(jié)構(gòu)域的蛋白互作。可見,OsLIR1蛋白可能在水稻生長發(fā)育、光合作用及響應(yīng)外界脅迫中起重要作用。②OsLIR1的表達(dá)具有光周期和節(jié)律性,主要集中在植物綠色組織中表達(dá),對(duì)多種非生物脅迫響應(yīng)水稻幼苗在12 h光照/12 h黑暗條件下培養(yǎng)三天,定量PCR結(jié)果顯示,OsLIR1的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的光周期特性;而在24 h光照/24 h黑暗條件下培養(yǎng)三天,OsLIR1的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯的節(jié)律性。OsLIR1在水稻組織中的表達(dá)模式分析顯示,該基因多在綠色組織中表達(dá),其中以葉片中表達(dá)最為豐富,根中的表達(dá)最少。在非生物脅迫處理后,OsLIR1的表達(dá)量在低溫和UV照射下顯著升高,而在高濃度NaCl環(huán)境下顯著降低。③oslir1的下調(diào)表達(dá)抑制植物的生長,改變?nèi)~綠體的內(nèi)部結(jié)構(gòu)通過rnai技術(shù)研究oslir1的下調(diào)表達(dá)對(duì)水稻植株生長發(fā)育的影響。結(jié)果表明,oslir1下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致水稻植株生長被抑制、葉片早衰、花發(fā)育畸形、結(jié)實(shí)率低等表型。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),oslir1下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系葉綠素含量較野生型下降,光合效率較野生型顯著降低,但最大光化學(xué)效率(fv/fm)及psii量子產(chǎn)額(Φpsii)沒有明顯變化。定量pcr結(jié)果顯示,葉綠素降解途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)顯著升高而葉綠體相關(guān)功能基因轉(zhuǎn)錄水平下降。透射電鏡觀察葉綠體內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn):與野生型比,轉(zhuǎn)基因植株葉綠體內(nèi)的類囊體膜分布稀疏,基粒跺疊厚度明顯降低。光系統(tǒng)蛋白復(fù)合體的研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因株系的光系統(tǒng)ii超復(fù)合體明顯解離并消失。這些結(jié)果說明oslir1可能是通過影響光捕獲復(fù)合體的穩(wěn)定性,降低葉片中的葉綠素含量,最終影響葉綠體的功能。④oslir1在黑暗誘導(dǎo)葉片衰老過程中具有維持類囊體膜穩(wěn)定性的重要作用黑暗條件下處理4d和6d后,與野生型相比,轉(zhuǎn)基因植株葉片的衰老速度加快,葉綠素含量下降顯著,fv/fm和Φpsii迅速下降,葉綠素降解途徑關(guān)鍵基因表達(dá)明顯上升,葉綠體相關(guān)功能基因的表達(dá)明顯下降。葉綠體類囊體膜加速降解,葉綠體迅速瓦解。類囊體膜上光系統(tǒng)ii復(fù)合體解離加速,相關(guān)系統(tǒng)ii蛋白表達(dá)下降明顯。以上結(jié)果表明,oslir1在黑暗脅迫條件下維持類囊體膜穩(wěn)定是必不可少的。⑤oslir1和cp29(光系統(tǒng)ii捕獲復(fù)合體4,lhcb4)相互作用以日本晴水稻全生育期的葉片為材料構(gòu)建酵母雙雜交cdna文庫。以oslir1作誘餌蛋白篩選酵母cdna文庫,共篩選到包括cp29在內(nèi)的8個(gè)候選互作蛋白。酵母共轉(zhuǎn)化結(jié)果發(fā)現(xiàn),oslir1和cp29在酵母體內(nèi)互作;bifc(雙分子熒光互補(bǔ))結(jié)果發(fā)現(xiàn)oslir1和cp29在煙草表皮細(xì)胞內(nèi)的葉綠體中互作;pull-down結(jié)果也證明oslir1和cp29在體外是互作的。oslir1和cp29的互作從機(jī)理上闡述了該蛋白在維持光系統(tǒng)ii超復(fù)合體結(jié)構(gòu)中的重要作用,在一定程度上解釋了轉(zhuǎn)基因植株葉片出現(xiàn)早衰的原因。上述結(jié)果表明oslir1是一個(gè)影響葉綠體結(jié)構(gòu)和功能的光調(diào)蛋白。另一個(gè)在植物生長發(fā)育中起到重要作用的是膨脹素基因。膨脹素具有誘導(dǎo)細(xì)胞壁膨脹的能力,是調(diào)控植物生長發(fā)育的重要因子之一,但在水稻中關(guān)于膨脹素基因功能的報(bào)道還比較少。在本文中,研究了一個(gè)水稻β亞族膨脹素基因osexpb2的功能,主要結(jié)果如下:①多重序列比對(duì)分析表明osexpb2含有β亞族特有的保守序列,進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)osexpb2和其它物種的膨脹素β亞族蛋白在進(jìn)化上聚為一個(gè)大分支;②構(gòu)建35S::OsEXPB2-GFP亞細(xì)胞定位載體,瞬時(shí)轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該蛋白定位在細(xì)胞壁上;③OsEXPB2集中在水稻根中表達(dá),且在營養(yǎng)缺乏脅迫條件下,受缺鐵、缺磷環(huán)境的誘導(dǎo)表達(dá),在激素處理下,該基因的表達(dá)受激素ABA的抑制;④轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),OsEXPB2的表達(dá)下調(diào)顯著降低了主根長度和根系直徑,根毛發(fā)育也受到嚴(yán)重影響,進(jìn)而影響地上部的株高和葉寬。上述結(jié)果表明,OsEXPB2是一個(gè)在根中大量表達(dá)的基因,在水稻根毛發(fā)育和根系形態(tài)建成過程中起關(guān)鍵作用,為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中根系育種改良提供了一個(gè)有應(yīng)用價(jià)值的候選基因。
【關(guān)鍵詞】：水稻 葉綠體 OsLIR1 OsEXPB2 根發(fā)育
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• 英文摘要6-14
• 1 緒論14-30
• 1.1 研究背景14-27
• 1.1.1 光信號(hào)傳導(dǎo)途徑14-19
• 1.1.2 類囊體膜系統(tǒng)19-22
• 1.1.3 葉綠素代謝途徑22-24
• 1.1.4 膨脹素的研究進(jìn)展24-27
• 1.2 研究內(nèi)容和研究目的27-30
• 1.2.1 研究意義及目的27-28
• 1.2.2 主要研究內(nèi)容28-29
• 1.2.3 技術(shù)路線29-30
• 2 OsLIR1下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出葉片早衰等多種表型30-54
• 2.1 引言30
• 2.2 材料和方法30-36
• 2.2.1 材料及生長條件30-32
• 2.2.2 干擾載體構(gòu)建32-34
• 2.2.3 生物信息學(xué)分析34
• 2.2.4 遺傳轉(zhuǎn)化34
• 2.2.5 基因表達(dá)特性分析34-35
• 2.2.6 脅迫處理35
• 2.2.7 葉綠素含量和光合參數(shù)測(cè)定35
• 2.2.8 葉綠體類囊體膜蛋白的提取35
• 2.2.9 藍(lán)綠溫和電泳35
• 2.2.10 原生質(zhì)體制備，轉(zhuǎn)化和瞬時(shí)檢測(cè)35
• 2.2.11 透射電鏡（TEM）35-36
• 2.2.12 統(tǒng)計(jì)分析36
• 2.3 結(jié)果36-52
• 2.3.1 OsLIR1的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)36-37
• 2.3.2 OsLIR1的表達(dá)特性37-41
• 2.3.3 OsLIR1的亞細(xì)胞定位41-42
• 2.3.4 OsLIR1下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的獲得和表型分析42-45
• 2.3.5 OsLIR1的下調(diào)表達(dá)影響了植株的葉綠素含量45-47
• 2.3.6 OsLIR1的下調(diào)表達(dá)影響葉綠體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化47-48
• 2.3.7 OsLIR1的下調(diào)表達(dá)影響葉綠素代謝相關(guān)基因的表達(dá)48-51
• 2.3.8 OsLIR1的下調(diào)表達(dá)影響了內(nèi)囊體膜復(fù)合體的穩(wěn)定性51-52
• 2.4 討論52-53
• 2.4.1 OsLIR1具有光周期和節(jié)律性52
• 2.4.2 OsLIR1是影響水稻生長發(fā)育的一個(gè)重要基因52-53
• 2.4.3 OsLIR1影響水稻葉綠體的發(fā)育和功能53
• 2.5 小結(jié)53-54
• 3 Os LIR1的下調(diào)表達(dá)在黑暗條件下加速了水稻葉片的早衰和葉綠體的瓦解54-66
• 3.1 引言54-55
• 3.2 方法55
• 3.2.1 植物生長條件55
• 3.2.2 黑暗處理方法55
• 3.2.3 葉綠素含量的測(cè)定和光合參數(shù)的檢測(cè)55
• 3.2.4 透射電鏡觀察葉綠體結(jié)構(gòu)55
• 3.2.5 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上的定量分析55
• 3.2.6 BN-PAGE和Western Blot分析55
• 3.3 結(jié)果55-63
• 3.3.1 OsLIR1下調(diào)表達(dá)在黑暗誘導(dǎo)后加速植株葉片衰老和低的光化學(xué)效率55-56
• 3.3.2 OsLIR1的下調(diào)表達(dá)在黑暗條件下加速植株葉綠體的降解56-58
• 3.3.3 黑暗誘導(dǎo)條件下，，OsLIR1下調(diào)表達(dá)的植株中參與葉綠素代謝相關(guān)基因的表達(dá)分析58-61
• 3.3.4 OsLIR1的下調(diào)表達(dá)在黑暗條件下降低植株光合復(fù)合體的穩(wěn)定性61-63
• 3.4 討論63
• 3.4.1 OsLIR1下調(diào)表達(dá)加速植株在黑暗誘導(dǎo)下的葉綠素降解和葉片衰老63
• 3.4.2 OsLIR1在葉綠素蛋白復(fù)合體穩(wěn)定性和葉綠體降解中的重要角色63
• 3.5 本章小結(jié)63-66
• 4 酵母雙雜交文庫的構(gòu)建和Os LIR1互作蛋白分析66-82
• 4.1 引言66
• 4.2 材料和方法66-74
• 4.2.1 材料及培養(yǎng)條件66-67
• 4.2.2 酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建67-70
• 4.2.3 酵母雙雜交篩選70-71
• 4.2.4 酵母質(zhì)粒的提取71-72
• 4.2.5 小量LiAc酵母轉(zhuǎn)化72-73
• 4.2.6 BiFC載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化煙草葉片表皮細(xì)胞73-74
• 4.2.7 Pull down體外蛋白互作74
• 4.3 結(jié)果74-80
• 4.3.1 酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建74-75
• 4.3.2 OsLIR1和OsCP29蛋白互作75-78
• 4.3.3 BiFC和Pull down驗(yàn)證78-80
• 4.4 討論80-82
• 5 OsEXPB2影響水稻植物根系的形成和地上部的生長發(fā)育82-94
• 5.1 引言82
• 5.2 方法82-84
• 5.2.1 材料和生長條件82-83
• 5.2.2 OsEXPB2的生物信息學(xué)分析83
• 5.2.3 載體構(gòu)建83
• 5.2.4 定量PCR分析83
• 5.2.5 脅迫處理83-84
• 5.2.6 亞細(xì)胞定位84
• 5.2.7 電鏡和組織切片分析84
• 5.2.8 統(tǒng)計(jì)分析84
• 5.3 結(jié)果84-91
• 5.3.1 OsEXPB2的鑒定和啟動(dòng)子分析84-87
• 5.3.2 OsEXPB2的亞細(xì)胞定位87
• 5.3.3 OsEXPB2的表達(dá)模式分析87-89
• 5.3.4 OsEXPB2對(duì)植物根系建成的影響89-91
• 5.4 討論91-92
• 5.5 本章小結(jié)92-94
• 6 結(jié)論和展望94-98
• 6.1 結(jié)論94-96
• 6.2 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)96
• 6.3 論文不足之處及后續(xù)工作展望96-98
• 致謝98-100
• 參考文獻(xiàn)100-118
• 附錄118-134
• A. 作者在攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的論文目錄118
• B. 作者在攻讀學(xué)位期間科研項(xiàng)目支撐118-119
• 縮寫詞119-121
• 培養(yǎng)基及緩沖液配方121-130
• 載體圖譜130-134

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本文編號(hào)：393215