發(fā)布時間：2017-05-25 07:08

  本文關(guān)鍵詞：核糖體結(jié)合蛋白ObgE的結(jié)構(gòu)與功能研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：GTP酶是重要的細胞調(diào)控因子,它通過GTP/GDP狀態(tài)間的轉(zhuǎn)換作用于許多生物學過程。Obg是P-loop GTP酶家族的一員,作為一種從細菌到人類都十分保守的GTP酶,Obg參與了許多細胞活動,例如,大腸桿菌中的同源物ObgE(Obg in E.coli)就涉及細胞內(nèi)兩個重要的調(diào)控過程,即核糖體組裝和嚴緊反應,但目前這些功能的分子機制尚不明確。本研究利用冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)方法解析了ObgE與核糖體50S大亞基復合物的結(jié)構(gòu),接著應用生化手段,闡述了ObgE的生理功能及作用機制。首先,我們利用冷凍電鏡研究了50S·ObgE·GMPPNP復合物的三維結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)分析表明保守的ObgE N端結(jié)構(gòu)域能夠通過模仿tRNA與核糖體的肽基轉(zhuǎn)移酶中心發(fā)生特異性的相互作用,這方面性質(zhì)與I類釋放因子的作用機制十分相似。同時,ObgE的結(jié)合導致核糖體50S大亞基發(fā)生了顯著的構(gòu)象變化,直接破壞了50S與30S結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。接著,通過預穩(wěn)態(tài)快速動力學檢測的方法,我們證明了ObgE的確是抑制核糖體結(jié)合的因子,通過結(jié)合于50S大亞基來阻止70S復合物的形成,從而阻止蛋白質(zhì)翻譯的起始。另一方面,ObgE結(jié)合50S大亞基以及抑制70S復合物形成的功能均受到鳥苷酸的調(diào)控,不僅是GTP和GDP,還包括參與細菌嚴緊反應調(diào)控的鳥苷四磷酸——ppGpp。在結(jié)合ppGpp之后,ObgE展現(xiàn)出較強的50S親和能力,導致核糖體結(jié)合和解離的平衡反應向70S復合物解離的方向移動。因此,我們認為ObgE作為特殊的翻譯因子與細菌的嚴緊反應密切相關(guān),這也為未來研究ObgE與核糖體相關(guān)(p)ppGpp調(diào)控因子的相互作用提供了一些線索。綜合已有的報道及本研究獲得的結(jié)果,我們推測在正常生長條件下,ObgE很可能在50S大亞基組裝后期充當質(zhì)量控制檢查點蛋白,監(jiān)督核糖體的成熟情況。而ObgE更主要的功能則是在特定的饑餓環(huán)境下,通過感知(p)ppGpp的水平來判斷細胞內(nèi)的能量狀態(tài),從而調(diào)控核糖體50S大亞基的量和翻譯速度,最終將核糖體組裝、翻譯與其他生長調(diào)控通路聯(lián)系起來。
【關(guān)鍵詞】：ObgE 冷凍電鏡 ppGpp 核糖體組裝 嚴緊反應
【學位授予單位】：清華大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q51
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 主要符號對照表10-11
• 第1章 引言11-44
• 1.1 原核細菌的核糖體11-17
• 1.1.1 原核細菌核糖體的結(jié)構(gòu)11-14
• 1.1.2 原核細菌核糖體的功能14-17
• 1.2 原核細菌核糖體的組裝17-22
• 1.2.1 原核細菌核糖體 50S大亞基的體外組裝17-19
• 1.2.2 原核細菌核糖體 50S大亞基的體內(nèi)組裝19
• 1.2.3 原核細菌核糖體 50S大亞基的體外組裝與體內(nèi)組裝對比19-20
• 1.2.4 原核細菌核糖體組裝因子20-22
• 1.3 原核細菌的嚴緊反應22-25
• 1.3.1 原核細菌的嚴緊反應概述22
• 1.3.2 RleA和SpoT的結(jié)構(gòu)與功能22-23
• 1.3.3 大腸桿菌的嚴緊反應調(diào)控23-25
• 1.4 Obg蛋白的結(jié)構(gòu)與功能25-33
• 1.4.1 Obg蛋白的結(jié)構(gòu)信息27-29
• 1.4.2 Obg蛋白在核糖體成熟過程中的功能29-30
• 1.4.3 Obg蛋白在嚴緊反應中的功能30-31
• 1.4.4 Obg蛋白在其他細胞調(diào)控過程中的功能31-32
• 1.4.5 真核細菌中Obg的同源蛋白32-33
• 1.5 冷凍電子顯微學33-43
• 1.5.1 冷凍電鏡概述33-36
• 1.5.2 透射電子顯微鏡的基本部件及成像原理36-39
• 1.5.3 單顆粒三維重構(gòu)方法39-41
• 1.5.4 冷凍電子顯微學的最新進展41-43
• 1.6 本課題的研究意義43-44
• 第2章 ObgE與核糖體 50S大亞基的相互作用44-54
• 2.1 引言44
• 2.2 實驗材料44-45
• 2.2.1 實驗儀器44-45
• 2.2.2 實驗試劑45
• 2.3 實驗方法45-48
• 2.3.1 pET28a-obgE及其突變的質(zhì)粒構(gòu)建45-46
• 2.3.2 ObgE及其突變蛋白的表達純化46-47
• 2.3.3 大腸桿菌核糖體的純化47
• 2.3.4 ObgE與核糖體 50S大亞基的結(jié)合47-48
• 2.3.5 ObgE與核糖體 70S復合物的結(jié)合48
• 2.4 實驗結(jié)果48-52
• 2.4.1 ObgE蛋白的純化48
• 2.4.2 核糖體 50S大亞基純化結(jié)果48-49
• 2.4.3 ObgE與核糖體 50S大亞基的結(jié)合49-51
• 2.4.4 ObgE與核糖體 70S復合物的結(jié)合51-52
• 2.5 分析討論52-54
• 第3章 ObgE與核糖體 50S大亞基復合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)54-74
• 3.1 引言54
• 3.2 實驗材料54
• 3.2.1 實驗儀器54
• 3.2.2 實驗試劑54
• 3.3 實驗方法54-63
• 3.3.1 50S·ObgE的冷凍電鏡樣品制備54-56
• 3.3.2 冷凍電鏡照片收集56-59
• 3.3.3 冷凍電鏡數(shù)據(jù)處理59-62
• 3.3.4 分子動力學模擬和原子模型搭建62-63
• 3.4 實驗結(jié)果63-72
• 3.4.1 ObgE·GMPPNP和核糖體 50S大亞基的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)63-68
• 3.4.2 ObgE N端結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)肽反應中心的相互作用68-71
• 3.4.3 ObgE的N端結(jié)構(gòu)域的形狀模仿A位點tRNA的接受臂71-72
• 3.5 分析討論72-74
• 第4章 ObgE在核糖體組裝過程及嚴緊反應中的作用74-95
• 4.1 引言74
• 4.2 實驗材料74-75
• 4.2.1 實驗儀器74
• 4.2.2 實驗試劑74-75
• 4.3 實驗方法75-81
• 4.3.1 細菌生長速率測定75
• 4.3.2 核糖體組成分析75
• 4.3.3 共沉淀實驗75-76
• 4.3.4 表面等離子體共振實驗76-79
• 4.3.5 核糖體 70S復合物拆分79
• 4.3.6 核糖體組裝動力學79-80
• 4.3.7 二肽合成80
• 4.3.8 體外翻譯實驗80-81
• 4.3.9 GTP酶活性測定81
• 4.4 實驗結(jié)果81-93
• 4.4.1 ppGpp促進ObgE與核糖體 50S大亞基的結(jié)合81-84
• 4.4.2 ObgE促進核糖體 70S復合物的解離84-86
• 4.4.3 ObgE是依賴核糖體 50S大亞基的抑制結(jié)合因子86-91
• 4.4.4 ObgE是一個與眾不同的核糖體依賴GTP酶91-93
• 4.5 分析討論93-95
• 第5章 ObgE、SpoT與核糖體 50S大亞基的關(guān)系95-104
• 5.1 引言95
• 5.2 實驗材料95
• 5.2.1 實驗儀器95
• 5.2.2 實驗試劑95
• 5.3 實驗方法95-98
• 5.3.1 pETDuet-spoT-obgE質(zhì)粒的構(gòu)建95-96
• 5.3.2 SpoT和ObgE的共表達及SpoT的純化96
• 5.3.3 SpoT與核糖體 50S大亞基的結(jié)合96-97
• 5.3.4 SpoT、ObgE二者與核糖體 50S大亞基的結(jié)合97
• 5.3.5 50S·SpoT的冷凍電鏡樣品制備97-98
• 5.4 實驗結(jié)果98-102
• 5.4.1 SpoT和ObgE的共表達及SpoT的純化98-99
• 5.4.2 SpoT與核糖體 50S大亞基的結(jié)合99
• 5.4.3 SpoT、ObgE二者與核糖體 50S大亞基的結(jié)合99-101
• 5.4.4 SpoT與核糖體 50S大亞基復合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)101-102
• 5.5 分析討論102-104
• 第6章 討論與展望104-111
• 6.1 討論104-110
• 6.1.1 ObgE在核糖體 50S大亞基組裝方面的作用104-106
• 6.1.2 GTP酶在核糖體 50S大亞基組裝時期的作用順序106-109
• 6.1.3 ObgE作為抑制結(jié)合因子在嚴緊反應中發(fā)揮重要作用109
• 6.1.4 ObgE的功能與其他細胞通路的聯(lián)系109-110
• 6.2 展望110-111
• 參考文獻111-124
• 致謝124-126
• 個人簡歷、在學期間發(fā)表的學術(shù)論文與研究成果126

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本文編號：392991