發(fā)布時間：2017-05-22 18:08

  本文關(guān)鍵詞：Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遺傳學(xué)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：許多細(xì)菌和大多數(shù)的古菌基因組均編碼稱作CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated)的獲得性免疫系統(tǒng)來抵御病毒或質(zhì)粒的侵害。CRISPR-Cas系統(tǒng)被分為3個主要類型,I型,II型和III型,又被進(jìn)一步劃分為11個亞型。Sulfolobus islandicus Rey15A編碼一個I-A亞型(Cascade)和兩個III-B亞型(Cmr-α和Cmr-β)CRISPR-Cas干涉系統(tǒng),本研究項目開始以前,這些系統(tǒng)中的cas基因的功能未被解析,而且,當(dāng)時已研究過的Cmr系統(tǒng)被證實在體外切割RNA,但它們的體內(nèi)RNA切割活性并未被證實。本研究的以S.islandicus Rey15A為研究材料,解析了I-A亞型系統(tǒng)中每個Cas蛋白在CRISPR介導(dǎo)的DNA干涉中的功能,另外,明確地證實了Cmr系統(tǒng)的體內(nèi)RNA干涉活性。為了分析S.islandicus Rey5A I-A亞型系統(tǒng)中單個cas基因在入侵物免疫過程中的功能,我們構(gòu)建了S.islandicus Rey5A I-A亞型系統(tǒng)中單個cas基因以及除I-A亞型系統(tǒng)外的其它幾個cas基因座的缺失株。對每個缺失株在pre-cr RNA加工及質(zhì)粒干涉方面的表型進(jìn)行分析后,結(jié)果說明,Cas7,Cas5,Cas6和Cas3為I-A亞型系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA干涉所必需的蛋白成分,然而,Csa5及其它幾個CRISPR-Cas系統(tǒng)均不參與此過程。Cas6被證實為此菌株中唯一一個負(fù)責(zé)pre-cr RNA加工的酶,同時Cas7,Cas5和Cas3也介入此過程。Cas7和Cas5分別穩(wěn)定pre-cr RNA加工中間產(chǎn)物和成熟cr RNA;缺少Cas3后加工中間產(chǎn)物大量積累,但其中涉及的原理目前未知。S.islandicus Rey15A Cmr系統(tǒng)介導(dǎo)的的體內(nèi)RNA干涉活性的確定是通過構(gòu)建一個RNA干涉試驗來實現(xiàn)的。RNA干涉試驗的原理是在質(zhì)粒上表達(dá)一個人工CRISPR(artificial CRISPR;所得到質(zhì)粒稱為p AC質(zhì)粒),該人工CRISPR含有一個來源于β-糖苷酶編碼基因lac S的spacer,因此,從p AC上表達(dá)出來的cr RNA能夠介導(dǎo)Qg源CRISPR-Cmr系統(tǒng)對lac S信使RNA進(jìn)行干涉,而干涉效果可以通過檢測p AC轉(zhuǎn)化子細(xì)胞提取物中殘留的β-糖苷酶活性來進(jìn)行評估。在不同的Cmr基因座缺失株中檢測RNA干涉活性結(jié)果顯示,只有兩個Cmr基因座均缺失的突變株失去了RNA干涉能力,說明每個Cmr系統(tǒng)均參與了體內(nèi)RNA干涉。在spacer的不同位點引入突變并用來構(gòu)建p AC質(zhì)粒,通過檢測這些突變對RNA干涉活性的影響,一個位于cr RNA 3’端的3 nt長的序列被確定為對RNA干涉活性至關(guān)重要。對p AC轉(zhuǎn)化子中未被切割的lac S信使RNA的量用實時定量PCR進(jìn)行評估的結(jié)果進(jìn)一步證實了Cmr介導(dǎo)的體內(nèi)RNA切割活性。3’-RACE結(jié)果顯示,lac S信使RNA中的剪切位點被定位在S1 protospacer序列內(nèi),結(jié)果還表明,Cmr-α利用尺標(biāo)原理在測定的(間隔6 nt)位點對RNA進(jìn)行切割,而Cmr-β則利用序列特異性原理在類似UA(UA,UG或UU)位點切割protospacer RNA。
【關(guān)鍵詞】：冰島硫化葉菌 CRISPR-Cas DNA/RNA干涉 遺傳分析
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q933
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 縮略語表10-11
• 1 前言11-46
• 1.1 CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及其功能11-13
• 1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)多樣性及其分類13-16
• 1.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的病毒防御原理16-43
• 1.3.1 新spacer的獲取18-20
• 1.3.2 CRISPR RNA加工20-25
• 1.3.3 Ⅰ型Cascade介導(dǎo)依賴PAM識別的DNA干涉25-34
• 1.3.4 Ⅱ型和Ⅲ-A亞型CRISPR-Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的DNA干涉簡介34-37
• 1.3.5 Ⅲ-B亞型Cmr系統(tǒng)介導(dǎo)RNA干涉37-43
• 1.4 S islandicus Rey15A中CRISPR-Cas干涉系統(tǒng)43-45
• 1.5 本研究目的45-46
• 2 材料與方法46-58
• 2.1 實驗材料46-49
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒46-48
• 2.1.2 分子生物學(xué)實驗材料48
• 2.1.3 Sulfolous細(xì)胞培養(yǎng)48-49
• 2.2 實驗方法49-58
• 2.2.1 Sulfolobus感受態(tài)制備及電轉(zhuǎn)化49-50
• 2.2.2 cas敲除質(zhì)粒及cas缺失株的構(gòu)建50-51
• 2.2.3 cas互補(bǔ)質(zhì)粒,DNA、RNA干涉質(zhì)粒構(gòu)建51-54
• 2.2.4 Sulfolobus總RNA提取及Northern分析54-55
• 2.2.5 cDNA合成,qPCR及RACE55-56
• 2.2.6 β-糖苷酶試驗56-58
• 3 結(jié)果與分析58-76
• 3.1 I-A亞型系統(tǒng)中Cas蛋白在pre-crRNA加工及PAM依賴型DNA干涉中功能的遺傳學(xué)鑒定58-64
• 3.1.1 cas缺失株的構(gòu)建58-59
• 3.1.2 對Cascis,Cmr-α和Cmr-β是否參與pre-crRNA加工和DNA干涉的確定59-61
• 3.1.3 S islandicus Rey15A I-A亞型CRISPR-Cas系統(tǒng)中Cas6,Cas7,Cas5和Csa5蛋白功能分析61-63
• 3.1.4 Cas3(解旋酶-核酸酶)在pre-crRNA加工及DNA干涉過程中的功能分析63-64
• 3.2 Ⅲ-B亞型Cmr系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA干涉的體內(nèi)分析64-76
• 3.2.1 S.islandicus內(nèi)源CRISPR系統(tǒng)介導(dǎo)的RNA干涉活性研究64-67
• 3.2.2 pAC質(zhì)粒表達(dá)的crRNA對S.islandicus Rey15A中靶基因表達(dá)高效抑制作用的鑒定67-68
• 3.2.3 S1 crRNA 3’端一個3nt序列對Cmr介導(dǎo)的體內(nèi)RNA干涉重要性的確定68-71
• 3.2.4 S.islandicus中Ⅲ-B亞型Cmr系統(tǒng)介導(dǎo)的基因沉默分析71-72
• 3.2.5 S.islandicus Cmr系統(tǒng)執(zhí)行的RNA剪切特征的分析72-76
• 4 討論76-84
• 4.1 關(guān)于S.islandicus I-A亞型Cascade的組裝76-78
• 4.2 關(guān)于S.islandicus CRISPR-Cmr系統(tǒng)介導(dǎo)的干涉復(fù)合體對靶RNA的識別78-79
• 4.3 關(guān)于6亞基Cmr復(fù)合體組裝樣式和靶RNA切割特征79-81
• 4.4 Cmr-α與Cmr-β能否相互轉(zhuǎn)化?81-82
• 4.5 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用前景82-84
• 參考文獻(xiàn)84-97
• 附錄97-104
• 附錄1-本研究所用引物97-103
• 附錄2-Sulfobus培養(yǎng)基基礎(chǔ)鹽及維他命溶液配方103-104
• 博士期間研究成果104-105
• 致謝105

【共引文獻(xiàn)】

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10 楊q

本文編號：386462