本文關(guān)鍵詞：APE1促進(jìn)DNA-PKcs介導(dǎo)hnRNPA1磷酸化及其在有絲分裂期端粒保護(hù)中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景細(xì)胞在有絲分裂的過(guò)程中,端粒不僅能夠阻止核酸酶對(duì)染色體的降解,而且可以通過(guò)抑制DNA損傷反應(yīng)(DNA damage reaction,DDR)防止親代細(xì)胞染色體末端相互融合以及非整倍體子代細(xì)胞的產(chǎn)生,從而預(yù)防由于基因組不穩(wěn)定性引起親代和/或子代細(xì)胞衰老、凋亡或癌變等嚴(yán)重后果的發(fā)生。端粒功能的維持依賴于端粒相關(guān)結(jié)合蛋白,其中hn RNPA1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1)的作用尤為重要。為了阻止端粒單鏈DNA被誤識(shí)別為損傷的DNA而誘發(fā)DDR,hn RNPA1能夠開(kāi)啟端粒單鏈DNA上RPA(replication protein A)向POT1(protection of telomeres 1)轉(zhuǎn)換,進(jìn)而有效地抑制DDR通路上游的關(guān)鍵激酶ATR(ataxia-telangiectasia and Rad3-related)被RPA激活。近年研究發(fā)現(xiàn)hn RNPA1是DNA-PKcs(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)的磷酸化底物,且DNA-PKcs缺失會(huì)導(dǎo)致大量端粒融合的現(xiàn)象,因而我們推測(cè)DNA-PKcs可能通過(guò)調(diào)控hn RNPA1活性發(fā)揮了端粒保護(hù)作用。此外,DNA-PKcs作為DNA依賴性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase,DNA-PK)的催化亞基是DNA雙鏈斷裂修復(fù)(double strand break repair,DSBR)中關(guān)鍵的限速酶,而大量研究證據(jù)表明脫嘌呤脫嘧啶核酸內(nèi)切酶/氧化還原因子(Apurinic aprimidinic endonuclease 1,APE1)從基因轉(zhuǎn)錄水平或翻譯后修飾水平可調(diào)控大量DSBR相關(guān)蛋白的表達(dá)及其活性,進(jìn)而既保持了染色體的完整性又確保了基因組的穩(wěn)定性,但是APE1是否調(diào)控DNA-PKcs蛋白激酶進(jìn)而促進(jìn)其對(duì)端粒的保護(hù)作用仍不清楚。本研究擬利用人工合成的端粒單鏈DNA、hn RNPA1純化蛋白、特異性抑制劑和基因敲除細(xì)胞株,通過(guò)運(yùn)用蛋白功能位點(diǎn)突變、GST-pulldown、磁珠pulldown法和染色體定向熒光原位雜交等技術(shù),以期研究雙功能蛋白APE1調(diào)控DNA-PKcs蛋白激酶的分子機(jī)制,并進(jìn)一步探討有絲分裂過(guò)程中DNA-PKcs磷酸化hn RNPA1的調(diào)控機(jī)制及其在介導(dǎo)端粒單鏈DNA上RPA向POT1轉(zhuǎn)換過(guò)程中的重要作用,最終闡明“APE1—DNA-PKcs—hn RNPA1”調(diào)控通路對(duì)有絲分裂期端粒的保護(hù)作用,為揭示細(xì)胞端粒的保護(hù)機(jī)制具有重要意義。研究目的1.研究APE1氧化還原功能調(diào)控DNA-PKcs激酶活性的分子機(jī)制;2.探討DNA-PKcs在有絲分裂期磷酸化hn RNPA1的調(diào)控機(jī)制;3.探明磷酸化的hn RNPA1促進(jìn)端粒單鏈DNA上RPA向POT1轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)作用及其對(duì)有絲分裂期端粒的保護(hù)作用。研究?jī)?nèi)容和方法1.APE1氧化還原功能對(duì)DNA-PKcs激酶活性的影響:以APE1穩(wěn)定敲低型和氧化還原缺失型細(xì)胞株為主要研究對(duì)象,同時(shí)通過(guò)Western blot、免疫熒光共聚焦顯微鏡、DNA末端連接活性分析和免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)方法觀察APE1及其氧化還原功能對(duì)DNA-PKcs的蛋白表達(dá)、激酶活性及NHEJ修復(fù)活性的調(diào)控作用,旨在為研究APE1氧化還原功能的生物學(xué)新效應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。2.DNA-PKcs激酶介導(dǎo)有絲分裂期hn RNPA1磷酸化的機(jī)制研究:利用底物磷酸化抗體、特異性激酶抑制劑、功能位點(diǎn)突變的hn RNPA1表達(dá)載體以及純化蛋白等,通過(guò)運(yùn)用細(xì)胞周期同步法、Western Blot、免疫共沉淀和GST-pulldown的實(shí)驗(yàn)方法揭示DNA-PKcs與hn RNPA1相互結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,以及細(xì)胞內(nèi)DNA-PKcs結(jié)合并磷酸化hn RNPA1的影響因素,旨在為詮釋DNA-PKcs與hn RNPA1之間相互作用的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.hn RNPA1磷酸化促進(jìn)其對(duì)有絲分裂期端粒的保護(hù)作用:以hn RNPA1敲除及其功能突變的細(xì)胞系為主要研究對(duì)象,同時(shí)輔以特異性激酶抑制劑,人工合成的端粒單鏈DNA和肽核酸端粒熒光原位雜交探針等手段和工具,以期回答磷酸化hn RNPA1對(duì)端粒單鏈DNA上RPA向POT1轉(zhuǎn)換的調(diào)控及其在有絲分裂期端粒保護(hù)中的作用,旨在系統(tǒng)性地闡明hn RNPA1在端粒相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)控軸。研究結(jié)果1.APE1氧化還原功能對(duì)DNA-PKcs激酶活性的影響:APE1與DNA-PKcs可形成蛋白復(fù)合物,并且APE1氧化還原功能功能并不調(diào)控DNA-PKcs的轉(zhuǎn)錄表達(dá),而是影響DNA-PKcs激酶活性及其N(xiāo)HEJ修復(fù)活性。2.DNA-PKcs激酶介導(dǎo)有絲分裂期hn RNPA1磷酸化的機(jī)制研究:在G2/M期的細(xì)胞中,hn RNPA1與DNA-PKcs之間的親和力以及hn RNPA1磷酸化水平均最高,且DNA-PKcs磷酸化hn RNPA1的位點(diǎn)是第95位和192位絲氨酸;通過(guò)結(jié)構(gòu)域圖譜測(cè)繪分析發(fā)現(xiàn)hn RNPA1主要結(jié)合DNA-PKcs的PIKK調(diào)控結(jié)構(gòu)域,而DNA-PKcs主要與hn RNPA1的RRMs結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)磷酸化模擬突變型hn RNPA1結(jié)合端粒單鏈DNA的親和力明顯高于DNA-PKcs,導(dǎo)致端粒單鏈DNA對(duì)DNA-PKcs與hn RNPA1相互結(jié)合具有拮抗作用。3.hn RNPA1磷酸化促進(jìn)其對(duì)有絲分裂期端粒的保護(hù)作用:磷酸化模擬突變型hn RNPA1結(jié)合端粒單鏈DNA的親和力以及促進(jìn)端粒單鏈DNA上RPA向POT1轉(zhuǎn)換的能力均明顯高于去磷酸化突變型hn RNPA1;DNA-PKcs及其激酶活性可調(diào)控hn RNPA1結(jié)合端粒單鏈DNA的親和力以及hn RNPA1取代端粒單鏈DNA上RPA的能力,并且DNA-PKcs敲除細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)酸磷酸化模擬突變型hn RNPA1蛋白會(huì)逆轉(zhuǎn)DNA-PKcs敲除導(dǎo)致hn RNPA1取代RPA能力下降的效應(yīng);通過(guò)端粒熒光原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)有絲分裂期hn RNPA1敲除后導(dǎo)致端粒區(qū)DDR,而hn RNPA1磷酸化會(huì)削弱有絲分裂期細(xì)胞內(nèi)DDR;進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)hn RNPA1敲除細(xì)胞或表達(dá)去磷酸化突變型hn RNPA1的細(xì)胞中有絲分裂期出現(xiàn)異常端粒的百分比均高于野生型細(xì)胞或表達(dá)磷酸化模擬突變型hn RNPA1的細(xì)胞。結(jié)論1.雙功能蛋白APE1通過(guò)與DNA-PKcs相互結(jié)合進(jìn)而從翻譯后修飾的水平調(diào)控DNA-PKcs的激酶活性及其功能,且該調(diào)控過(guò)程依賴于APE1 redox功能。2.細(xì)胞在有絲分裂過(guò)程中,DNA-PKcs與hn RNPA1之間的親和力最強(qiáng),通過(guò)DNA-PKcs的C末端PIKK調(diào)控結(jié)構(gòu)域與hn RNPA1的RRMs結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合。3.DNA-PKcs的PIKK結(jié)構(gòu)域具有底物磷酸化的功能,可對(duì)位于hn RNPA1的RRMs結(jié)構(gòu)域內(nèi)第95和192位絲氨酸進(jìn)行磷酸化修飾。4.hn RNPA1在有絲分裂期發(fā)生過(guò)度磷酸化以后,可高效地募集至端粒單鏈DNA上。5.細(xì)胞在有絲分裂過(guò)程中,過(guò)度磷酸化的hn RNPA1通過(guò)高效地移除端粒單鏈DNA上單鏈結(jié)合蛋白R(shí)PA,以及有效地促進(jìn)POT1與端粒單鏈DNA結(jié)合,進(jìn)而避免DDR通路上游的關(guān)鍵激酶ATR被RPA激活。6.過(guò)度磷酸化的hn RNPA1能夠充分地抑制有絲分裂期端粒區(qū)域的DDR,并且有效地防止端粒融合、丟失等異常情況的發(fā)生。
【關(guān)鍵詞】：基因組不穩(wěn)定 細(xì)胞周期 端粒 DNA損傷反應(yīng) 氧化還原 磷酸化 單鏈DNA 脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶 DNA依賴性蛋白激酶 核不均一核糖核蛋白A1 復(fù)制蛋白A 端粒保護(hù)蛋白1 共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變和Rad3相關(guān)激酶
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：Q253;Q756
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-7
• 英文摘要7-11
• 中文摘要11-14
• 第一章 前言14-18
• 第二章 APE1氧化還原功能對(duì)DNA-PKcs激酶活性的影響18-39
• 2.1 材料與方法18-30
• 2.2 結(jié)果30-37
• 2.3 討論37-39
• 第三章 DNA-PKcs激酶介導(dǎo)有絲分裂期hnRNPA1磷酸化的機(jī)制研究39-85
• 3.1 材料與方法39-66
• 3.2 結(jié)果66-82
• 3.3 討論82-85
• 第四章 hnRNPA1磷酸化促進(jìn)其對(duì)有絲分裂期端粒的保護(hù)作用85-112
• 4.1 材料與方法85-99
• 4.2 結(jié)果99-109
• 4.3 討論109-112
• 全文結(jié)論112-113
• 參考文獻(xiàn)113-119
• 文獻(xiàn)綜述 Shelterin復(fù)合物如何保護(hù)哺乳動(dòng)物端粒119-128
• 參考文獻(xiàn)124-128
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果128-130
• 致謝130

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  本文關(guān)鍵詞：APE1促進(jìn)DNA-PKcs介導(dǎo)hnRNPA1磷酸化及其在有絲分裂期端粒保護(hù)中的作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：379153