本文關(guān)鍵詞：吡喃糖氧化酶和漆酶在木質(zhì)素生物降解中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元通過碳碳鍵和醚鍵連接而成的天然高分子聚合物。它是自然界中含量僅次于纖維素的第二大可再生有機(jī)資源。木質(zhì)素非常難以降解,在植物細(xì)胞壁中,它與半纖維素一起包裹著纖維素,對(duì)植物起保護(hù)作用。木質(zhì)素的降解是自然界碳素循環(huán)的限速步驟。然而,對(duì)于生物質(zhì)資源的利用,木質(zhì)素的存在是一個(gè)障礙。木質(zhì)素的生物降解是實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源有效利用的一條重要途徑。白腐真菌是自然界中唯一能夠徹底將木質(zhì)素分解為CO2和H2O的生物。木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、錳過氧化物酶(MnP)和漆酶是白腐真菌產(chǎn)生的說要木質(zhì)素降解酶。然而,這些酶在胞外很難實(shí)現(xiàn)對(duì)天然木質(zhì)素的徹底降解,反而更傾向于導(dǎo)致木質(zhì)素的聚合。這說明白腐真菌在體內(nèi)必定有一套人們尚未發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)木質(zhì)素聚合和降解的機(jī)制。吡喃糖2-氧化酶(P2O)在白腐真菌中廣泛存在。它可以氧化多種吡喃糖C-2位產(chǎn)生相應(yīng)的酮糖,同時(shí)將O2還原為H2O2。P2O在白腐真菌中的作用被認(rèn)為是為過氧化物酶提供H2O2。有研究表明,對(duì)于P2O,一些醌類和自由基是比O2更好的電子受體。鑒于此,P2O可能通過還原木素降解過程中產(chǎn)生的自由基和醌類中間體來抑制它們的聚合,與木質(zhì)素降解酶協(xié)同作用,促進(jìn)木質(zhì)素的降解。但這個(gè)推測(cè)尚未得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。因此,本研究的目的之一就是探討P2O和漆酶在木質(zhì)素降解中的協(xié)同作用。漆酶能對(duì)多種底物進(jìn)行單電子氧化,這使其在制漿造紙、廢水處理、有機(jī)合成等多個(gè)工業(yè)領(lǐng)域有誘人的應(yīng)用前景。最近,漆酶在木質(zhì)素改性,促進(jìn)木質(zhì)素的高值化利用方面也引起了人們的關(guān)注。尋找適合工業(yè)應(yīng)用的漆酶是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室保存了大量的白腐真菌菌種資源,其中Trametes trogii YDHSD是一株非常高效的漆酶產(chǎn)生菌。本論文對(duì)T. trogii漆酶進(jìn)行了分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究,并探討了它在堿木素改性和染料脫色中的應(yīng)用。本論文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：1.吡喃糖-2-氧化酶(P2O)的分離純化和表征使用硫酸銨分級(jí)沉淀、疏水層析、陰離子交換層析、凝膠過濾層析等方法從白腐真菌Irpex lacteus dft-1中分離純化得到一種氧化葡萄糖并產(chǎn)H2O2的酶,純化倍數(shù)27.9,得率27.4%。經(jīng)TLC和GC-MS分析,該酶氧化葡萄糖的產(chǎn)物為2-酮-D-葡萄糖,從而確定該酶為P20,而非葡萄糖-1-氧化酶。凝膠過濾顯示該酶分子量為266 kDa, SDS-PAGE顯示亞基分子量為71 kDa,表明該酶有4個(gè)亞基。該酶表現(xiàn)出典型黃素蛋白的紫外可見光譜特征。該酶的最適pH為6.5,最適溫度為55℃,在較寬的pH范圍(5-11)和溫度范圍內(nèi)(低于60℃)都非常穩(wěn)定。D-葡萄糖、D-半乳糖、L-山梨糖、D-木糖和D-葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯等多種單糖都可被該酶氧化,少數(shù)雙糖,比如麥芽糖和纖維二糖也能被I. lacteus P20氧化。對(duì)這些糖類底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Kcat的測(cè)定表明,D-葡萄糖是該酶的最適底物。P2O不僅對(duì)其電子供體具有非特異性,對(duì)電子受體也表現(xiàn)出非特異性。除了O2,對(duì)苯醌、甲基對(duì)苯醌、2,6-二甲基對(duì)苯醌、DCIP等醌類物質(zhì)和ABTS陽離子自由基也可以作為P2O的電子受體。根據(jù)動(dòng)力學(xué)參數(shù)判斷,某些醌類甚至比O2更容易被P20還原。自由基和醌類是木質(zhì)素降解的重要中間產(chǎn)物。P20還原醌類底物的特性可能在木質(zhì)素的生物降解中起重要作用。2.P2O和漆酶在木質(zhì)素降解中的協(xié)同作用研究使用分光光度法發(fā)現(xiàn)漆酶可以氧化2,6-DMP、愈創(chuàng)木酚、兒茶酚等酚類化合物和木素磺酸鹽,產(chǎn)生醌類結(jié)構(gòu),導(dǎo)致特定波長下的吸光度增加。P2O的加入可以還原反應(yīng)生成的這些醌類物質(zhì)。為了研究P2O和漆酶在木質(zhì)素生物降解中的協(xié)同作用,對(duì)四種工業(yè)木質(zhì)素,即木素磺酸鹽、堿木素、蔗渣CEL、桉木CEL,分別進(jìn)行漆酶單獨(dú)處理和漆酶與P20共同處理。使用GPC分析了酶作用后的木質(zhì)素的分子量分布。結(jié)果表明,在漆酶的作用下,木質(zhì)素發(fā)生了聚合,分子量增大。然而,P2O的加入有效地抑制了聚合,甚至引起木素磺酸鹽的降解。另外,紅外光譜分析表明單獨(dú)漆酶處理對(duì)木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)影響不大。而當(dāng)P2O與漆酶協(xié)同處理時(shí),木質(zhì)素中的共軛羰基含量顯著增加,這很有可能是木質(zhì)素結(jié)構(gòu)單元中Cα氧化的結(jié)果。這表明,P2O的加入促進(jìn)了漆酶對(duì)木質(zhì)素的氧化。以上結(jié)果說明,P2O能夠還原木質(zhì)素氧化過程中產(chǎn)生的自由基和醒類中間體,從而抑制漆酶催化的木質(zhì)素的聚合,并能在一定程度上促進(jìn)木質(zhì)素的氧化降解。除了為LiP和MnP提供H2O2,抑制木質(zhì)素降解碎片的再聚合可能是P2O的另外一個(gè)生理功能。鑒于P2O在白腐真菌中的廣泛分布,P2O與漆酶或過氧化物酶協(xié)作維持一種氧化還原循環(huán),可能是白腐真菌用來調(diào)控木質(zhì)素聚合和降解的一種通用機(jī)制。3.漆酶的分離純化和表征利用硫酸銨分級(jí)沉淀、陰離子交換層析、凝膠過濾層析等手段,從白腐真菌T. trogii YDHSD中分離純化得到一種藍(lán)漆酶。該酶是一個(gè)單體蛋白,根據(jù)SDS-PAGE測(cè)定的分子量為64 kDa。該酶對(duì)不同底物的最適pH在2.2到4.5范圍內(nèi),最適溫度為70℃。該漆酶表現(xiàn)出較高的熱穩(wěn)定性,60℃半衰期為1.6小時(shí)。該漆酶底物范圍非常廣泛,一系列酚類化合物都能被其氧化。另外,該漆酶能在不加介體的情況下直接氧化非酚型偶氮染料甲基紅。根據(jù)其動(dòng)力學(xué)參數(shù)判斷,ABTS是該漆酶的最適底物。與其它漆酶相比,該漆酶對(duì)ABTS和丁香醛連氮有非常高的親和力。而且,該漆酶具有良好的金屬離子耐受性。這些優(yōu)良特性說明T. trogii漆酶具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。4.漆酶對(duì)堿木素的改性GPC分析表明T. trogii該漆酶可以有效地氧化堿木素導(dǎo)致其聚合。堿木素聚合反應(yīng)的最適pH在6到6.5范圍內(nèi)。在pH6.5的緩沖液中,經(jīng)漆酶處理后24 h后,堿木素的重均分子量增大了5.4倍。FTIR、元素分析和1H NMR分析表明,漆酶處理導(dǎo)致堿木素的官居能團(tuán)發(fā)生改變。經(jīng)漆酶氧化聚合,堿木素中的羰基和脂肪族羥基含量增加,甲氧基含量減少。酚羥基含量少量增加。此外,木素氧化過程中縮合結(jié)構(gòu)含量增加。這些結(jié)果表明,T. trogii漆酶在木質(zhì)素改性中具有潛在的的應(yīng)用價(jià)值。5.漆酶在染料脫色中的應(yīng)用T. trogii漆酶可以在不加介體的情況下直接對(duì)多種染料氧化脫色,包括蒽醌類染料茜紅素S、RBBR,三苯甲烷類染料溴酚藍(lán)、亮綠,偶氮類染料甲基紅、甲基橙、剛果紅等。反應(yīng)的pH、溫度、染料初始濃度和漆酶加入量對(duì)脫色效率均具有不同程度的影響。在加入介體的情況下,該漆酶可以氧化脫色的染料范圍變得更為廣泛,十余種不同染料都可被其脫色。不同的介體對(duì)染料脫色的促進(jìn)效果有所不同。
【關(guān)鍵詞】：自腐真菌 木質(zhì)素 吡喃糖氧化酶 漆酶 染料脫色
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：O636.2;Q814
【目錄】：

• 摘要12-15
• ABSTRACT15-19
• 符號(hào)說明19-21
• 第一章 研究背景21-53
• 1.1 木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)與生物合成21-28
• 1.1.1 木質(zhì)素的分布與結(jié)構(gòu)21-25
• 1.1.2 木質(zhì)素的生物合成25-28
• 1.2 木質(zhì)素的生物降解28-33
• 1.2.1 木質(zhì)素降解與生物質(zhì)資源的利用28-29
• 1.2.2 白腐真菌及其木質(zhì)素降解系統(tǒng)的特點(diǎn)29-30
• 1.2.3 木質(zhì)素降解相關(guān)酶30-32
• 1.2.4 參與木質(zhì)素降解的活性小分子物質(zhì)32-33
• 1.3 吡喃糖氧化酶33-38
• 1.3.1 吡喃糖氧化酶的性質(zhì)33-35
• 1.3.2 吡喃糖氧化酶的生理作用35-37
• 1.3.2.1 為木素降解過氧化物酶提供H20235-36
• 1.3.2.2 參與抗生素藍(lán)草菌酮的合成36
• 1.3.2.3 參與木質(zhì)素降解中的還原反應(yīng)36-37
• 1.3.3 吡喃糖氧化酶的應(yīng)用37-38
• 1.4 漆酶38-51
• 1.4.1 漆酶的研究進(jìn)程38-39
• 1.4.2 漆酶的分布39-41
• 1.4.2.1 植物漆酶39
• 1.4.2.2 動(dòng)物漆酶39-40
• 1.4.2.3 真菌漆酶40
• 1.4.2.4 原核生物漆酶40-41
• 1.4.3 漆酶的結(jié)構(gòu)和理化特征41-45
• 1.4.3.1 漆酶的分子量41-42
• 1.4.3.2 漆酶的糖基化42
• 1.4.3.3 漆酶的等電點(diǎn)42
• 1.4.3.4 漆酶的三維結(jié)構(gòu)42-43
• 1.4.3.5 漆酶的活性中心和催化機(jī)理43-45
• 1.4.4 漆酶的底物45-46
• 1.4.5 漆酶/介體系統(tǒng)(LMS)46-48
• 1.4.6 漆酶的應(yīng)用48-51
• 1.4.6.1 造紙工業(yè)48-49
• 1.4.6.2 環(huán)境保護(hù)與修復(fù)49-50
• 1.4.6.3 木質(zhì)纖維材料的改性50
• 1.4.6.4 漆酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用50-51
• 1.5 本課題的意義、目的和研究內(nèi)容51-53
• 第二章 吡喃糖氧化酶的純化和表征53-73
• 引言53-54
• 2.1 材料與方法54-58
• 2.1.1 試劑54
• 2.1.2 菌株與培養(yǎng)方法54
• 2.1.3 P2O酶活和蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定54
• 2.1.4 P2O的分離純化54-55
• 2.1.5 P2O的酶學(xué)性質(zhì)研究55-58
• 2.1.5.1 SDS-PAGE和Native-PAGE55-56
• 2.1.5.2 分子量測(cè)定56
• 2.1.5.3 葡萄糖氧化產(chǎn)物的制備和鑒定56-57
• 2.1.5.4 P2O紫外可見吸收光譜的測(cè)定57
• 2.1.5.5 pH對(duì)P2O活性和穩(wěn)定性的影響57
• 2.1.5.6 溫度對(duì)P2O活性和穩(wěn)定性的影響57
• 2.1.5.7 P2O底物廣泛性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定57-58
• 2.2 結(jié)果與討論58-72
• 2.2.1 P2O的純化58-60
• 2.2.2 P2O氧化葡萄糖產(chǎn)物的鑒定60-62
• 2.2.3 P2O的分子量測(cè)定62-63
• 2.2.4 P2O的紫外可見光譜學(xué)特征63
• 2.2.5 pH對(duì)P2O活性和穩(wěn)定性的影響63-65
• 2.2.6 溫度對(duì)P2O活性和穩(wěn)定性的影響65-66
• 2.2.7 P2O的底物特異性及動(dòng)力學(xué)特征66-72
• 2.3 本章小結(jié)72-73
• 第三章 P2O與漆酶在木質(zhì)素降解中的協(xié)同作用73-85
• 引言73-74
• 3.1 材料與方法74-76
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)用酶及木質(zhì)素的制備74
• 3.1.2 P2O對(duì)漆酶催化生成的醌類的作用74-75
• 3.1.3 漆酶和P2O協(xié)同處理工業(yè)木質(zhì)素75
• 3.1.4 木質(zhì)索的GPC分析75
• 3.1.5 木質(zhì)素的FTIR分析75-76
• 3.2 結(jié)果76-81
• 3.2.1 P2O對(duì)漆酶催化產(chǎn)生的醌類的還原76-77
• 3.2.2 漆酶和P2O協(xié)同處理工業(yè)木質(zhì)素77-79
• 3.2.3 木質(zhì)素的FTIR分析79-81
• 3.3 討論81-83
• 3.4 本章小結(jié)83-85
• 第四章 漆酶的分離純化和表征85-99
• 引言85
• 4.1 材料與方法85-88
• 4.1.1 菌株和培養(yǎng)條件85-86
• 4.1.2 漆酶活性和蛋白濃度測(cè)定86
• 4.1.3 漆酶的分離純化86-87
• 4.1.4 漆酶的酶學(xué)性質(zhì)研究87-88
• 4.1.4.1 漆酶的電泳分析87
• 4.1.4.2 漆酶的紫外-可見光譜分析87
• 4.1.4.3 pH對(duì)漆酶活性和穩(wěn)定性的影響87
• 4.1.4.4 溫度對(duì)漆酶活性和穩(wěn)定性的影響87-88
• 4.1.4.5 漆酶底物特異性和酶促動(dòng)力學(xué)88
• 4.1.4.6 金屬離子和抑制劑對(duì)漆酶活性的影響88
• 4.2 結(jié)果與討論88-98
• 4.2.1 漆酶的純化及其分子特征88-90
• 4.2.2 pH對(duì)漆酶活性和穩(wěn)定性的影響90-91
• 4.2.3 溫度對(duì)漆酶活性和穩(wěn)定性的影響91-92
• 4.2.4 漆酶底物特異性及其酶促動(dòng)力學(xué)特征92-95
• 4.2.5 金屬離子和抑制劑對(duì)漆酶活性的影響95-98
• 4.3 本章小結(jié)98-99
• 第五章 漆酶對(duì)木質(zhì)素的改性99-111
• 引言99-100
• 5.1 材料與方法100-101
• 5.1.1 漆酶對(duì)堿木素的處理100
• 5.1.2 木質(zhì)素的GPC分析100-101
• 5.1.3 木質(zhì)素的紅外光譜分析101
• 5.1.4 木質(zhì)素的元素分析101
• 5.1.5 木質(zhì)素的~1H NMR分析101
• 5.2 結(jié)果與討論101-109
• 5.2.1 漆酶在不同pH下對(duì)堿木素的聚合作用101-104
• 5.2.2 FTIR分析104-107
• 5.2.3 元素分析和~1H NMR107-109
• 5.3 本章小結(jié)109-111
• 第六章 漆酶催化染料脫色的研究111-127
• 引言111-112
• 6.1 材料與方法112-114
• 6.1.1 主要試劑和儀器112
• 6.1.2 漆酶酶活的測(cè)定方法112
• 6.1.3 染料的紫外可見光譜¨描112-113
• 6.1.4 漆酶對(duì)染料的脫色實(shí)驗(yàn)113
• 6.1.5 漆酶/介體體系對(duì)染料的脫色113-114
• 6.2 結(jié)果與討論114-126
• 6.2.1 染料的紫外可見光譜114-116
• 6.2.2 pH對(duì)染料脫色的影響116-117
• 6.2.3 溫度對(duì)染料脫色的影響117-118
• 6.2.4 染料初始濃度對(duì)脫色的影響118-119
• 6.2.5 漆酶量對(duì)染料脫色的影響119-120
• 6.2.6 染料脫色過程中的紫外可見光譜120-121
• 6.2.7 漆酶價(jià)體體系對(duì)染料的脫色121-126
• 6.3 本章小結(jié)126-127
• 全文總結(jié)與展望127-129
• 參考文獻(xiàn)129-153
• 致謝153-154
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表文章154-155
• 譯文155-173
• 附件173

【共引文獻(xiàn)】

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9 朱萍;水葫蘆厭氧發(fā)酵的研究[D];安徽師范大學(xué);2011年

10 蔡沖;枇杷和水蜜桃果實(shí)主要采后生理變化及其相關(guān)調(diào)控措施研究[D];浙江大學(xué);2003年

  本文關(guān)鍵詞：吡喃糖氧化酶和漆酶在木質(zhì)素生物降解中作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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