本文關(guān)鍵詞：大鼠CRISP2與PDIA3的相互作用及其在睪丸和精子中的定位研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：哺乳動物精卵融合屬于細(xì)胞膜融合的一種,它包括很多復(fù)雜的步驟,是精卵細(xì)胞上多種蛋白因子相互識別、相互作用并且逐漸發(fā)生反應(yīng)的過程。迄今文獻(xiàn)報(bào)道在卵子和精子上分別鑒定出若干種與精卵融合相關(guān)的蛋白因子,卵子上有JUNO、CD9、CD81和GPI-Aps等,精子上有PDIA3、CRISP2、CRISP1、 SLLP1、Equatorin及Izumo1等,但在精卵融合過程中,這些蛋白質(zhì)分子究竟以何種方式參與了此過程,目前仍然不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)選取了大鼠的CRISP2和PDIA3為研究對象,研究精子表面的蛋白之間的相互作用,為解析哺乳動物精卵融合的分子機(jī)制提供線索。我們在Ensemb1數(shù)據(jù)庫(http://www.ensembl.org/index.html)查詢分析大鼠Crisp2 (ENSRNOG00000013225)和Pdia3 (ENSRNOG00000015018)的cDNA序列,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所需引物；用RT-PCR方法克隆大鼠Crisp2和Pdia3的cDNA序列,構(gòu)建pET32a-Crisp2和pGEX4T-1-Pdia3原核表達(dá)載體,制備小鼠抗大鼠CRISP2和PDIA3的多克隆抗體,用免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)研究CRISP2和PDIA3蛋白在大鼠睪丸和精子頂體反應(yīng)前后的表達(dá)定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大鼠CRISP2和PDIA3蛋白大量出現(xiàn)于其睪丸曲精細(xì)管內(nèi)側(cè)至中央?yún)^(qū),即大鼠精子發(fā)生和成熟精子出現(xiàn)的區(qū)域。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示：在頂體反應(yīng)前的大鼠精子細(xì)胞中,CRISP2蛋白位于整個(gè)大鼠精子上,而大鼠PDIA3蛋白主要存在于精子頭、體部,在尾部只有少量分布；頂體反應(yīng)后大鼠CRISP2存在于精子體、尾部；而大鼠PDIA3發(fā)生頂體反應(yīng)后從精子上消失了。實(shí)驗(yàn)克隆到的大鼠Crisp2和Pdia3 cDNA長度分別為730 bp、497 bp,編碼243個(gè)氨基酸(amino acid簡寫為：aa,以下類同)和499個(gè)氨基酸,N端分別有22 aa和24 aa個(gè)氨基酸的信號肽。將克隆得到的大鼠Crisp2和Pdia3 cDNA的成熟肽亞克隆,并按照其多肽結(jié)構(gòu)域分為A、B兩段,分別與酵母雙雜交載體pGAD和pGBKT相連,構(gòu)建了分段pGAD-Crisp2A、pGAD-Crisp2B、 pGBKT-Pdia3A、pGBKT-Pdia3B及成熟肽全長pGAD-Crisp2、pGBKT-Pdia3酵母雙雜交載體,分組進(jìn)行酵母雙雜交,分析各段多肽之間的相互作用。同時(shí)也與真核載體pcDNA3.1相連,構(gòu)建了分段pcDNA-Crisp2A、pcDNA-Crisp2B、 pcDNA-Pdia3A、pcDNA-Pdia3B及成熟肽全長pcDNA-Crisp2、pcDNA-Pdia3表達(dá)載體。把上述的載體成對組合,共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,待表達(dá)目的蛋白后,進(jìn)行免疫共沉淀和Western blot分析CRISP2和PDIA3多肽片段之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示大鼠PDIA3-CRISP2成熟肽存在相互作用,各分段中CRISP2A-PDIA3A、CRISP2A-PDIA3B之間亦存在相互作用；CRISP2B-PDIA3A、CRISP2B-PDIA3B之間不存在相互作用。
【關(guān)鍵詞】：大鼠 CRISP2 PDIA3 免疫共沉淀 酵母雙雜交
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 符號說明4-5
• 摘要5-7
• ABSTRACT7-13
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述 膜融合機(jī)制的研究進(jìn)展13-27
• 1 歷史回顧13-14
• 2 病毒的膜融合機(jī)制14-16
• 2.1 Ⅰ型病毒的膜融合相關(guān)機(jī)制14-16
• 2.2 Ⅱ型病毒的膜融合相關(guān)機(jī)制16
• 3 體細(xì)胞膜融合機(jī)制16-18
• 4 動物生殖細(xì)胞膜融合相關(guān)機(jī)制18-25
• 4.1 卵子表面的精卵融合相關(guān)蛋白19-21
• 4.2 精子上的精卵融合相關(guān)蛋白因子21-24
• 4.3 精卵融合有關(guān)的酶24
• 4.4 精卵相互作用有關(guān)的抗原24-25
• 5 植物配子融合相關(guān)機(jī)制25-26
• 6 展望26-27
• 第二部分 研究論文27-101
• 第一章 大鼠Crisp2和Pdia3的cDNA的克隆27-44
• 前言27
• 1 材料與方法27-31
• 1.1 主要實(shí)驗(yàn)器材27-28
• 1.2 載體與苗種28
• 1.3 實(shí)驗(yàn)試劑與方法28-31
• 2 結(jié)果31-41
• 2.1 大鼠附睪、睪丸組織總RNA的提取31-32
• 2.2 大鼠Crisp2和Pdia3的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定32-33
• 2.3 pMD19-T重組載體的雙酶切鑒定33-34
• 2.4 大鼠PDIA3和CRISP2 cDNA結(jié)構(gòu)分析34
• 2.5 大鼠PDIA3和CRISP2氨基酸序列的分析34-36
• 2.6 大鼠PDIA3和CRISP2的二級結(jié)構(gòu)和性質(zhì)以及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測36-41
• 3 討論41-44
• 第二章 大鼠CRISP2和PDIA3融合蛋白的原核表達(dá)及純化44-57
• 前言44
• 1 材料和方法44-50
• 1.1 材料44-46
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法46-50
• 2 結(jié)果50-56
• 2.1 Pdia3和Crisp2全長測序結(jié)果分析(見第一章結(jié)構(gòu)分析)50-51
• 2.2 大鼠Pdia3和Crisp2 PCR產(chǎn)物、重組克隆T載體的構(gòu)建及pET32a-Crisp2、pGEX4T-1-Pdia3重組載體酶切鑒定51-52
• 2.3 pET32a-CRISP2、pGEX4T-1-PDIA3在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)與His-CRISP2、GST-PDIA3融合蛋白的Western-blot鑒定52-55
• 2.4 純化后的His-CRISP2和GST-PDIA3融合蛋白濃度的測定55-56
• 3 討論56-57
• 第三章 小鼠抗大鼠CRISP2和PDIA3腹水多克隆抗體的制備及純化57-66
• 前言57-58
• 1 材料和方法58-61
• 1.1 材料58
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法58-61
• 2 結(jié)果61-64
• 2.1 小鼠抗GST-PDIA3和His-CRISP2多克隆抗體的鑒定62
• 2.2 大鼠PDIA3和CRISP2純化抗體特異性測定62-63
• 2.3 CRISP2、PDIA3抗體的效價(jià)測定63-64
• 3 討論64-66
• 第四章 大鼠PDIA3和CRISP2蛋白在其睪丸組織和精子中的定位66-74
• 前言66
• 1 材料和方法66-69
• 1.1 材料66-68
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法68-69
• 2 結(jié)果69-72
• 2.1 大鼠睪丸組織中PDIA3和CRISP2的定位69-71
• 2.2 大鼠PDIA3和CRISP2在精子細(xì)胞頂體反應(yīng)前后不同形態(tài)的免疫化學(xué)定位71-72
• 3 討論72-74
• 第五章 大鼠PDIA3、CRISP2酵母雙雜交作用的研究74-87
• 前言74
• 1 材料與方法74-79
• 1.1 試劑74-76
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法76-79
• 2 結(jié)果79-85
• 2.1 大鼠Pdia3和Crisp2的PCR凝膠電泳79-80
• 2.2 pGADT7和pGBKT7酶切鑒定80-81
• 2.3 Y2H和Y187雙雜交目的陽性菌凝膠電泳鑒定81-82
• 2.4 酵母菌Y187和Y2H Gold交配82-83
• 2.5 SD/-Leu or如/-Trp的菌落生長結(jié)果83
• 2.6 SD/-Leu/-Trp的菌落生長結(jié)果83-84
• 2.7 SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a -Ga/Aba (QXA)的菌落生長結(jié)果84-85
• 3 討論85-87
• 第六章 大鼠PDIA3和CRISP2蛋白相互作用的研究87-101
• 前言87-88
• 1 材料與方法88-92
• 1.1 實(shí)驗(yàn)器材88
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法88-92
• 1.2.1 試劑88
• 1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成88-89
• 1.2.3 pcDNA表達(dá)載體的構(gòu)建89-90
• 1.2.4 293T細(xì)胞的培養(yǎng)90
• 1.2.5 細(xì)胞共轉(zhuǎn)染90-91
• 1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后目的蛋白收集91
• 1.2.7 免疫共沉淀91
• 1.2.8 目的蛋白的Western blot檢n,91-92
• 2 結(jié)果92-99
• 2.1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳分析鑒定92
• 2.2 pcDNA3.1表達(dá)載體的構(gòu)建及雙酶切分析92-94
• 2.3 目的蛋白Western blot結(jié)果94-99
• 3 討論99-101
• 結(jié)論101-102
• 參考文獻(xiàn)102-107
• 致謝107-108
• 攻讀博士學(xué)位期間參與的科研項(xiàng)目和發(fā)表的學(xué)術(shù)論文10

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1 奇 云;解讀大鼠基因有助人類攻克疑難病癥[N];大眾科技報(bào);2004年

2 記者 馮衛(wèi)東;大鼠研究顯示孕期壓力或可代代相傳[N];科技日報(bào);2014年

3 本報(bào)特約撰稿人 陸志城;用大鼠還是用小鼠？[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2004年

4 張?zhí)煨?克隆大鼠意義重大[N];中國醫(yī)藥報(bào);2003年

5 記者 藍(lán)建中;日本研究:骨髓移植使大鼠血管“返老還童”[N];新華每日電訊;2010年

6 記者 姜澎;聰明大鼠 解密大腦記憶功能[N];文匯報(bào);2009年

7 萬姍姍　記者 王春;轉(zhuǎn)基因“聰明大鼠”學(xué)得快記得牢[N];科技日報(bào);2009年

8 記者 曹繼軍 顏維琦 通訊員 孫國根;大鼠基因功能圖譜被成功繪制[N];光明日報(bào);2014年

9 記者 白毅 通訊員 孫國根;大鼠基因功能圖譜繪制成功[N];中國醫(yī)藥報(bào);2014年

10 記者 孫國根;將大鼠基因的功能“對號入座”[N];健康報(bào);2014年

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2 楊少兵;N-甲基-D-天冬氨酸受體2B亞基鎮(zhèn)痛疫苗應(yīng)用于大鼠的安全性評價(jià)[D];華中科技大學(xué);2009年

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4 史敏;慢性間歇性低壓低氧抗大鼠膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎作用及其免疫學(xué)機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

5 安平;柴夏煎對甲亢大鼠的影響及作用機(jī)理研究[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2005年

6 周宜;從大鼠性周期的分子變化探討柴胡止血液的作用[D];成都中醫(yī)藥大學(xué);2005年

7 張慶紅;白細(xì)胞介素2和雌激素受體在大鼠垂體前葉的相互關(guān)系研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2000年

8 張海峰;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠急性肝功能衰竭治療作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2007年

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本文編號：370809