線粒體是細(xì)胞中的能量工廠,也是細(xì)胞中多種代謝過(guò)程的中心。因此人類(lèi)健康與線粒體的穩(wěn)態(tài)及其正常功能的維持密不可分。本論文的研究圍繞線粒體,構(gòu)建了線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點(diǎn)的報(bào)告子,還研究了線粒體內(nèi)一個(gè)參與脯氨酸和鳥(niǎo)氨酸前體吡咯啉-5-羧酸（P5C）合成的酶P5CS調(diào)控線粒體內(nèi)多種代謝途徑的分子機(jī)制。線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點(diǎn)（MERCs）是線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之間進(jìn)行鈣離子及磷脂交換的位置,也是細(xì)胞多種信號(hào)通路交互的平臺(tái)。但目前對(duì)MERCs的組成、分布和動(dòng)態(tài)變化了解還十分有限。研究最大的困難是缺乏簡(jiǎn)單實(shí)用的指示MERCs的標(biāo)記物。本論文第一部分的研究構(gòu)建了一個(gè)全新的能指示MERCs的工具,并利用這個(gè)工具分析了在不同刺激下細(xì)胞內(nèi)MERCs的動(dòng)態(tài)變化。這一工具基于Split GFP的Split GFP1-10和Split GFP11距離接近時(shí)會(huì)相互作用折疊成可以發(fā)出綠色熒光的GFP的機(jī)理。我們將編碼Split GFP1-10和Split GFP11的DNA序列分別與編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體定位信號(hào)的DNA序列連接起來(lái),并在Split GFP11與線粒體定位序列間加入不同長(zhǎng)度的連接子,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。進(jìn)而在細(xì)胞中同時(shí)... 

【文章頁(yè)數(shù)】：128 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
致謝
摘要
Abstract
縮略詞表
1 緒論
    1.1 線粒體與人類(lèi)健康
    1.2 線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸
    1.3 脂代謝與疾病
    1.4 總結(jié)
2 線粒體-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點(diǎn)新型標(biāo)記工具的構(gòu)建及其特性研究
    2.1 前言
    2.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        2.2.1 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        2.2.3 報(bào)告子穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的構(gòu)建
        2.2.4 篩選報(bào)告子穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系
        2.2.5 細(xì)胞RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄
        2.2.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR
        2.2.7 免疫熒光制片
        2.2.8 細(xì)胞熒光成像的觀察與處理
        2.2.9 細(xì)胞電鏡
        2.2.10 細(xì)胞周期同步化處理
        2.2.11 藥物處理
        2.2.12 Western blot(WB)
        2.2.13 統(tǒng)計(jì)分析
        2.2.14 抗體信息
    2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        2.3.1 構(gòu)建能監(jiān)測(cè)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接觸位點(diǎn)的報(bào)告子
        2.3.2 報(bào)告子正確性的驗(yàn)證
        2.3.3 報(bào)告子靈敏度的檢驗(yàn)
        2.3.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)線粒體接觸位點(diǎn)的動(dòng)態(tài)性
        2.3.5 有絲分裂進(jìn)程中接觸位點(diǎn)的觀察
        2.3.6 MERCs與線粒體狀態(tài)高度相關(guān)
        2.3.7 MERCs豐度受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)影響不大
        2.3.8 不同胞內(nèi)應(yīng)激條件對(duì)MERCs的影響
    2.4 總結(jié)與討論
3 吡咯啉-5-羧酸合成酶可感知細(xì)胞應(yīng)激并通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體呼吸來(lái)調(diào)節(jié)其他代謝途徑
    3.1 前言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和siRNA序列信息
        3.2.2 哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染
        3.2.3 Cas9 方法制備P5CS敲除細(xì)胞系
        3.2.4 果蠅的管理及品系獲得
        3.2.5 熒光實(shí)時(shí)定量PCR
        3.2.6 細(xì)胞免疫熒光制片與觀察
        3.2.7 細(xì)胞內(nèi)脂消耗速率與合成速率的測(cè)量
        3.2.8 電鏡樣品的制備與觀察
        3.2.9 細(xì)胞增殖和存活實(shí)驗(yàn)
        3.2.10 線粒體蛋白酶K(PK)消化實(shí)驗(yàn)
        3.2.11 堿碳酸鹽萃取試驗(yàn)
        3.2.12 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(Co-IP)
        3.2.13 細(xì)胞線粒體壓力測(cè)試
        3.2.14 線粒體底物分析
        3.2.15 BN-PAGE分析線粒體復(fù)合物
        3.2.16 代謝組學(xué)試驗(yàn)
        3.2.17 圖像處理及統(tǒng)計(jì)分析
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 P5CS在線粒體內(nèi)呈棒狀或環(huán)狀分布
        3.3.2 P5CS點(diǎn)狀分布需要其多聚化位點(diǎn)
        3.3.3 P5CS在氧化應(yīng)激下定位趨向擴(kuò)散
        3.3.4 P5CS缺失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)脅迫敏感性增加及果蠅的神經(jīng)退行
        3.3.5 P5CS缺失導(dǎo)致多種代謝缺陷
        3.3.6 P5CS的缺失抑制β-氧化代謝
        3.3.7 P5CS對(duì)線粒體正常氧化呼吸的進(jìn)行至關(guān)重要
    3.4 總結(jié)討論
參考文獻(xiàn)
線粒體疾病
    綜述參考文獻(xiàn)
作者簡(jiǎn)歷



本文編號(hào)：3663490