本文關(guān)鍵詞：c-Myc蛋白去泛素化機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蛋白質(zhì)的泛素化修飾是一個受到精密調(diào)控的級聯(lián)酶促反應(yīng)。蛋白質(zhì)的泛素化可介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解,細(xì)胞增殖生長與分化,細(xì)胞免疫應(yīng)答,細(xì)胞凋亡,細(xì)胞內(nèi)膜蛋白的分選和運(yùn)送等過程。蛋白質(zhì)的泛素化修飾也是由去泛素化酶介導(dǎo)的一類可逆反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的去泛素化過程失調(diào)可導(dǎo)致諸如腫瘤等疾病的發(fā)生。USP37屬于去泛素化酶家族的半胱氨酸水解酶家族,能夠通過調(diào)控CyclinA蛋白穩(wěn)定性調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程由G1期進(jìn)入S期；USP37還能夠調(diào)控PLZF/RARA蛋白穩(wěn)定性進(jìn)而參與到急性早幼粒細(xì)胞白血病的發(fā)生中。已有的報(bào)道也表明USP37的表達(dá)受到REST的調(diào)控,進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控蛋白p27的蛋白穩(wěn)定性參與神經(jīng)細(xì)胞增殖；可見USP37在不同組織細(xì)胞中通過調(diào)控不同的底物發(fā)揮作用,已有的研究表明,USP37在非小細(xì)胞肺癌中是高表達(dá)的,但是在肺組織中USP37的底物及其與肺癌發(fā)生的關(guān)系目前還不清楚。轉(zhuǎn)錄因子c-Myc在多種組織和種屬中廣泛表達(dá),通過調(diào)控基因組15%基因的轉(zhuǎn)錄而參與到細(xì)胞周期調(diào)控,細(xì)胞代謝,細(xì)胞分化與衰老,蛋白質(zhì)合成,線粒體功能等生命活動過程中。細(xì)胞內(nèi)c-Myc功能失調(diào)會引起高達(dá)20%癌癥的發(fā)生。c-Myc發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用主要是通過其N端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域,協(xié)同bHLH結(jié)合蛋白MAX結(jié)合在包含特定DNA序列的基因啟動子區(qū)而啟動轉(zhuǎn)錄激活。細(xì)胞內(nèi)c-Myc的蛋白表達(dá)水平調(diào)控除了受到MAX形成異源二聚體調(diào)控外,轉(zhuǎn)錄,mRNA穩(wěn)定性,以及諸如磷酸化,乙酰化,泛素化等翻譯后修飾也會參與調(diào)控c-Myc的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)了調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的多個 E3 泛素連接酶,包括Fbw7,SKP2,HectH9等,這些 E3 通過對c-Myc的K48位的多泛素化將其靶定到蛋白酶體降解。c-MycT58及S62位的磷酸化對其同F(xiàn)bw7的結(jié)合并被其泛素化降解至關(guān)重要。相應(yīng)地,c-Myc的去泛素化酶卻只發(fā)現(xiàn)了USP28,并且USP28對c-Myc的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控是Fbw7依賴的,不能同F(xiàn)bw7結(jié)合的c-Myc的突變體則不能被USP28穩(wěn)定。但是,Fbw7在許多腫瘤中都是缺失或者突變的,那么這種情況下c-Myc的蛋白穩(wěn)定性是如何被調(diào)控的,是否存在新的直接的去泛素化酶調(diào)控c-Myc的蛋白穩(wěn)定性都還不清楚。此外,USP28對c-Myc的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控在肺癌細(xì)胞系中不成立的,那么在肺癌的發(fā)生過程中,是否存在去泛素化酶通過調(diào)控c-Myc蛋白穩(wěn)定性參與肺癌的發(fā)生也不清楚。在本論文中,我們通過分子生物學(xué),細(xì)胞生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)方法,發(fā)現(xiàn)了能夠直接調(diào)控c-Myc蛋白穩(wěn)定性的新的去泛素化酶USP37。USP37以不依賴于Fbw7的方式同c-Myc直接結(jié)合,去泛素化c-Myc,進(jìn)而通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子c-Myc下游基因的轉(zhuǎn)錄激活參與到c-Myc介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞增殖和瓦博格效應(yīng)等生物學(xué)過程中。另一方面,我們利用生物信息學(xué)及免疫組織化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)方法,對大量的肺癌病人組織樣本分析得出,USP37由于可能受到較低甲基化調(diào)控使其在肺癌中特異性高表達(dá),且其表達(dá)同c-Myc的表達(dá)有很好的正相關(guān)性。我們的研究為肺癌的臨床治療和相關(guān)藥物開發(fā)提供很好的藥物靶標(biāo)和可靠的理論基礎(chǔ)。本論文主要包括以下幾部分：一.c-Myc新的去泛素化酶USP37的鑒定我們在肺癌細(xì)胞系H1299中過表達(dá)若干去泛素化酶,篩選到去泛素化酶USP37顯著穩(wěn)定內(nèi)源c-Myc, USP37對c-Myc的調(diào)控是劑量依賴的,并且依賴于USP37的去泛素化酶活性。接著我們利用實(shí)驗(yàn)室的LPDS雙系統(tǒng)驗(yàn)證同熒光素酶融合的c-Myc也能被USP37穩(wěn)定,而活性缺失的USP37C350S卻不具有這種作用。在H1299細(xì)胞中,過表達(dá)USP37后,內(nèi)源c-Myc的半衰期明顯延長,表明USP37對c-Myc的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控發(fā)生在翻譯后修飾水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,去泛素化酶USP37在過表達(dá)的條件下穩(wěn)定c-Myc的蛋白穩(wěn)定性,而且這種作用依賴于USP37的去泛素化酶活性。二.USP37在肺癌細(xì)胞中調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的分子機(jī)制研究1.USP37對c-Myc蛋白穩(wěn)定性的機(jī)制研究USP37被干擾低表達(dá)時肺癌細(xì)胞中內(nèi)源c-Myc的蛋白水平也隨之明顯減少,而c-Myc的RNA水平并沒有明顯的變化,這表明USP37對c-Myc的蛋白穩(wěn)定性調(diào)控發(fā)生在翻譯后水平。接下來的pulse-chase實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)USP37被干擾低表達(dá)后,內(nèi)源c-Myc的半衰期明顯縮短。進(jìn)一步利用refeed的模型,將處于低血清濃度的細(xì)胞重新加入新鮮培養(yǎng)基,觀察一段時間內(nèi)內(nèi)源c-Myc蛋白水平的變化,結(jié)果表明,在refeed的過程中,c-Myc的蛋白穩(wěn)定性持續(xù)受到USP37的調(diào)控。2.USP37與c-Myc的相互作用通過免疫共沉淀試驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)USP37在體內(nèi)外同c-Myc直接結(jié)合。免疫熒光的實(shí)驗(yàn)得出USP37和c-Myc共定位在細(xì)胞核中。Pull Down實(shí)驗(yàn)證明USP37在體外可以同c-Myc直接結(jié)合。我們還構(gòu)建了c-Myc的分段克隆,利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)c-Myc的包含MBⅢ的中心段同USP37結(jié)合,并且缺失這一段的突變體不能被USP37穩(wěn)定。3.USP37去泛素化c-Myc通過Ni-NTA的方法表明,USP37可顯著去泛素化c-Myc,而USP37C350S則不能。進(jìn)一步在H1299細(xì)胞中干擾內(nèi)源USP37,檢測內(nèi)源c-Myc的泛素化水平,發(fā)現(xiàn)USP37低表達(dá)時,c-Myc的泛素化水平明顯上調(diào)。c-Myc的泛素化水平能夠明顯被USP37純蛋白減弱。上述結(jié)果表明,c-Myc在肺癌細(xì)胞中的蛋白水平受蛋白酶體的調(diào)控；體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)證明,USP37能夠直接同c-Myc結(jié)合并去泛素化c-Myc進(jìn)而對其穩(wěn)定性進(jìn)行調(diào)控。三.USP37在肺癌細(xì)胞中調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的相關(guān)生物學(xué)功能研究1.USP37促進(jìn)c-Myc介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的增殖通過MTT實(shí)驗(yàn)及克隆形成實(shí)驗(yàn)得出H1299細(xì)胞中干擾siRNA使USP37低表達(dá)時,能顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖。但是當(dāng)同時干擾掉c-Myc的表達(dá),再利用MTT及克隆形成的增值實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)USP37仍然能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖,但是同時敲除c-Myc時,肺癌細(xì)胞的增殖情況并無明顯變化。這些結(jié)果證明了USP37通過影響c-Myc而影響肺癌細(xì)胞的增殖。2.USP37促進(jìn)c-Myc介導(dǎo)的瓦伯格效應(yīng)在H1299中分別干擾USP37,c-Myc及同時干擾USP37和c-Myc,檢測葡萄糖攝取量及乳酸生成量。當(dāng)USP37下調(diào)時,葡萄糖攝取量及乳酸生成量明顯下降。而同時干擾USP37及c-Myc時,這兩項(xiàng)指標(biāo)并無明顯變化。證明USP37對反應(yīng)瓦伯格效應(yīng)的兩項(xiàng)指標(biāo)葡萄糖攝取量及乳酸生成量的影響是通過調(diào)控c-Myc的蛋白表達(dá)量實(shí)現(xiàn)的。同時我們檢測了位于c-Myc下游的受轉(zhuǎn)錄因子c-Myc調(diào)控的兩個瓦伯格效應(yīng)相關(guān)基因LDHA及Glut1的表達(dá),結(jié)果表明,干擾USP37可使位于c-Myc下游的瓦伯格效應(yīng)相關(guān)蛋白Glut1及LDHA下調(diào)。上述結(jié)果表明,USP37能以去泛素化酶活性依賴的方式促進(jìn)c-Myc介導(dǎo)的肺癌細(xì)胞的增殖。USP37通過穩(wěn)定c-Myc的蛋白表達(dá),上調(diào)位于轉(zhuǎn)錄因子c-Myc下游的瓦伯格效應(yīng)相關(guān)基因LDHA及Glut1而調(diào)控瓦博格效應(yīng)。四.USP37在肺癌病人組織樣品中同c-Myc表達(dá)相關(guān)性的研究通過免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn),分析了肺癌病人的肺癌組織及癌旁組織中USP37的表達(dá)情況。結(jié)果表明,在高達(dá)69%的包括肺鱗癌和肺腺癌的肺癌病人樣本中USP37在肺癌組織中特異性高表達(dá)。接著我們分析了TCGA數(shù)據(jù)庫里在肺癌病人組織樣品中,USP37同轉(zhuǎn)錄因子c-Myc下游的調(diào)控基因CNNB1的表達(dá)有很好的正相關(guān)性。接著分析了TCGA數(shù)據(jù)庫中多例肺癌組織中USP37基因甲基化水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),USP37在肺癌組織中的高表達(dá)是由于其基因較低的甲基化水平造成的。進(jìn)一步我們利用免疫組織化學(xué)的方法分析了肺癌組織中USP37表達(dá)同c-Myc表達(dá)的相關(guān)性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,USP37的表達(dá)同c-Myc的表達(dá)在肺癌病人組織樣品中有很好的正相關(guān)性。上述結(jié)果表明,去泛素化酶USP37在肺鱗癌及肺腺癌病人樣品中特異性高表達(dá),且USP37的基因表達(dá)收到甲基化調(diào)控,在肺癌病人組織樣品中,USP37的高表達(dá)是由于其較低的甲基化水平造成的。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,USP37的蛋白表達(dá)同c-Myc的蛋白表達(dá)具有很好的正相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：去泛素化 USP37 c-Myc Fbw7 肺癌發(fā)生
【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q51
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-16
• 目錄16-18
• 第一章 研究背景及文獻(xiàn)綜述18-33
• 一、蛋白質(zhì)的泛素化與去泛素化18-33
• (一)、蛋白質(zhì)的泛素化修飾18-20
• (二)、蛋白質(zhì)的去泛素化修飾20-28
• (三)、癌蛋白c-Myc28-33
• 第二章 c-Myc新的去泛素化酶USP37的鑒定33-51
• 一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器33-40
• 二、實(shí)驗(yàn)方法40-44
• 三、結(jié)果與分析44-49
• 四、小結(jié)與討論49-51
• 第三章 USP37在肺癌細(xì)胞中調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的分子機(jī)制研究51-80
• 一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器51-56
• 二、實(shí)驗(yàn)方法56-70
• 三、結(jié)果與分析70-79
• 四、小結(jié)與討論79-80
• 第四章 USP37在肺癌細(xì)胞中調(diào)控c-Myc穩(wěn)定性的相關(guān)生物學(xué)功能研究80-88
• 一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器80-81
• 二、實(shí)驗(yàn)方法81-83
• 三、結(jié)果與分析83-87
• 四、小結(jié)和討論87-88
• 第五章 USP37在肺癌病人樣品中同c-Myc表達(dá)相關(guān)性研88-103
• 一、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器88-90
• 二、實(shí)驗(yàn)方法90-97
• 三、結(jié)果與分析97-101
• 四、小結(jié)和討論101-103
• 第六章 論文總結(jié)及討論103-107
• 附錄Ⅰ 縮略詞107-109
• 附錄Ⅱ 科研成果109-110
• 參考文獻(xiàn)110-118
• 致謝118-

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