家蠶是一種完全變態(tài)昆蟲,幼蟲期是其整個生活史中生長發(fā)育和儲存能量的重要階段,因此幼蟲期致死對家蠶生命周期的影響無疑是巨大的,同時也會對養(yǎng)蠶生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。4齡幼蟲致死突變（lethal mutant in the fourth instar larvae,l-4i）是一種新的幼蟲期致死的突變體,本研究在對l-4i突變體遺傳分析的基礎上,采用圖位克隆技術對l-4i的突變基因進行了定位克隆,構建了遺傳連鎖圖,采用q RT-PCR、RNAi、酶活測定和添食特異性抑制劑方法對突變基因進行表達分析和功能驗證,證實了家蠶拓撲異構酶基因Bmtop的突變是導致l-4i突變體的主要原因,為進一步研究l-4i突變體致死的分子機制奠定了基礎。主要研究成果如下:一、l-4i突變體的表型特征與遺傳分析4齡幼蟲致死突變（lethal mutant in the fourth instar larvae,l-4i）是在對家蠶品種P33的飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)的一種新的幼蟲期致死型突變體,其特征為l-4i突變體幼蟲在3齡第2天就表現(xiàn)出體型較正常個體小,活力較差,生長發(fā)育緩慢的特征,3齡期延長約2天,4齡起蠶后極少進食... 

【文章來源】：江蘇科技大學江蘇省

【文章頁數(shù)】：95 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 緒論
    1.1 致死突變
        1.1.1 致死發(fā)生的原因
        1.1.2 致死基因的分類
    1.2 果蠅致死基因相關研究
        1.2.1 果蠅溫敏致死突變基因Pros（Pros261和Prosβ21）
        1.2.2 Triplo-lethal基因座
        1.2.3 果蠅拓撲異構酶
    1.3 家蠶致死基因的相關研究
        1.3.1 家蠶致死基因的相關研究
        1.3.2 家蠶致死基因的實際應用
    1.4 拓撲異構酶研究背景
        1.4.1 拓撲異構酶的分類
        1.4.2 拓撲異構酶的生物學功能
    1.5 基因功能的研究方法概述
        1.5.1 RNAi技術
        1.5.2 基因組編輯技術
        1.5.3 GAL4/UAS系統(tǒng)
    1.6 研究目的和意義
    1.7 主要研究內(nèi)容和方法
第二章 家蠶4齡幼蟲致死突變體l-4i的表型特征與遺傳分析
    2.1 實驗材料
    2.2 遺傳分析方法
    2.3 結果與分析
        2.3.1 l-4i突變體的形狀特征
        2.3.2 l-4i突變體的遺傳分析
    2.4 討論
第三章 家蠶4齡幼蟲致死突變體l-4i突變基因的連鎖及定位分析
    3.1 材料與試劑
        3.1.1 實驗材料
        3.1.2 主要儀器
        3.1.3 主要試劑
        3.1.4 常用試劑配制
    3.2 主要的實驗方法
        3.2.1 家蠶基因組DNA的提取方法
        3.2.2 PCR反應體系的構建
        3.2.3 瓊脂糖凝膠電泳
        3.2.4 多態(tài)性標記的篩選、連鎖分析
        3.2.5 新SSR標記的篩選及l(fā)-4i基因的精細定位和繪制基因連鎖圖
    3.3 實驗結果
        3.3.1 試驗材料飼養(yǎng)情況
        3.3.2 BC1F及BC1M個體的表型與基因型
        3.3.3 家蠶l-4i突變基因所在連鎖群的確定
        3.3.4 與家蠶l-4i基因連鎖的新的SSR標記
        3.3.5 BC1M回交群體的基因型分析及l(fā)-4i基因遺傳連鎖圖的構建
    3.4 討論
第四章 家蠶4齡幼蟲致死突變體l-4i候選基因的篩選
    4.1 實驗材料與試劑
        4.1.1 實驗材料的準備
        4.1.2 主要實驗儀器
        4.1.3 主要實驗試劑
    4.2 主要的實驗方法
        4.2.1 家蠶總RNA的提取
        4.2.2 總RNA經(jīng)DNase I處理
        4.2.3 第一鏈cDNA合成
        4.2.4 real-time PCR（RT-PCR）
        4.2.5 DNA片段的回收
        4.2.6 目的片段與pMD18-T載體連接
        4.2.7 大腸桿菌感受態(tài)的制備：
        4.2.8 質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化及陽性克隆篩選
        4.2.9 RNA interference （RNAi）
    4.3 實驗結果
        4.3.1 半定量方法篩選候選基因
        4.3.2 克隆測序方法篩選候選基因
        4.3.3 RNA interference （RNAi）初步驗證突變基因
        4.3.4 家蠶拓撲異構酶基因（Bmtop）組織表達譜和齡期表達譜
    4.4 討論
第五章 候選基因的功能驗證
    5.1 實驗材料與試劑
        5.1.1 實驗材料的準備
        5.1.2 主要實驗儀器
        5.1.3 主要實驗試劑
    5.2 主要實驗方法
        5.2.1 拓撲異構酶抑制劑喜樹堿（Camptothecin，CPT）添食實驗
        5.2.2 一步法提取家蠶活性總蛋白
        5.2.3 DNA超螺旋解旋法測定拓撲異構酶酶活力
    5.3 實驗結果
        5.3.1 CPT添食實驗
        5.3.2 拓撲異構酶酶活測定
    5.4 討論
結論
參考文獻
博士期間學術論文發(fā)表情況
致謝



本文編號：2912311