發(fā)布時間：2020-11-09 17:23

　　 當真核細胞面臨逆境條件時,細胞內會形成由m RNA結合且體積較大的細胞質顆粒物、核糖體元件和包括轉錄因子在內的RNA結合蛋白。在這些顆粒物形成的同時,細胞內的m RNA暫時保持沉默,使細胞的能量集中在轉錄與生存相關的蛋白。在逆境下因細胞轉錄中斷而合成的顆粒物可以被降解,當環(huán)境條件得到改善時重新進行轉錄。在這些顆粒物中,有兩種蛋白組分不同的RNA顆粒被區(qū)分開來:應激顆粒(Stress Granules),或稱應力顆粒,及過程產物P小體(Processing Bodies)。其中P小體的體積較小,形狀規(guī)則,常態(tài)時在細胞中亦有分布。應激顆粒是本課題主要的研究對象,它具有較大且不規(guī)則的形狀,由不翻譯的信使核糖核蛋白顆粒(messenger ribonucleo protein particle,m RNP)組成,其組裝是由各種環(huán)境壓力引發(fā)的,包括熱激,碳匱乏,過氧化,高滲透壓,病毒感染,紫外線照射等,但不包括X射線照射和DNA損傷劑逆境。形成RNA的細胞質顆粒的能力是細胞在壓力下生存的重要條件,也是打破自身凋亡和生存之間平衡的重要條件。對應激顆粒形成相關基因及作用規(guī)律的研究,在對釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)的應激能力提供了分子層面的解釋的同時,對于其他真核細胞在逆境下的存亡選擇依據和哺乳動物中癌細胞的形成機制也具有參考意義。至今,釀酒酵母(S.cerevisiae)中應激顆粒的具體成分、形成條件以及逆境激活信號通路的調控機制等問題尚不為人所知,說明上述機制正是本課題研究的目的。釀酒酵母(S.cerevisiae)的全基因組測序已完成,而自動化的合成遺傳陣列(Synthetic Genetic Array,SGA)分析技術和基因組水平的高通量的成像篩選技術也已經研制成功�；谏鲜黾夹g條件,本研究將帶有紅色熒光蛋白的應激顆粒標記物PAB1-RFP轉化到釀酒酵母(S.cerevisiae)基因組中,再通過SGA的融合技術,對帶有PAB1-RFP標記的4600株單基因敲除突變子和800株溫度敏感型突變子進行應激顆粒的逆境誘導,主要以脫氧葡萄糖處理為逆境條件,基于應激顆粒豐度,篩選出與野生型差別較大的突變子,分析這些突變子缺失基因的功能與應激顆粒組裝和分解之間的聯(lián)系,以此探明細胞在應激顆粒形成過程中涉及的生物代謝途徑。通過大規(guī)模篩選,發(fā)現(xiàn)了許多與應激顆粒形成相關的功能基因。經分析發(fā)現(xiàn)應激顆粒形成所需基因集中在:胞內體組分、核糖體組分、GARP復合物、EGO-GSE復合物和蛋白質折疊。而導致應激顆粒異常增多的缺失基因多與生物體膜結構、囊泡轉運以及自噬作用相關,作用于應激顆粒的分解。大多數(shù)表型突出的陰性突變子在面臨其他逆境條件時,如熱激、高滲透壓,仍然難以形成應激顆粒,但有一部分突變子的陰性表型是針對特定的逆境條件的。那些缺失后致使應激顆粒無法形成的蛋白,大多集中在低復雜度結構區(qū)域,說明很多非緊密結合的大分子與應激顆粒的結構完整性密切相關。熱激能在誘導應激顆粒形成的同時提高芽殖酵母的突變頻率,一些應激顆粒形成困難的突變子在熱激中顯示出更高的突變率,而這種特性僅存在于熱激逆境下。篩選結果中的幾個影響應激顆粒形成的突變會影響到Ran GTP酶和TOR代謝通路,調控RNA和蛋白質的核質運輸。在應激顆粒形成困難的突變子中,逆境調控的信號蛋白的轉錄達到了極端的程度:逆境誘導的m RNA積累的比野生型更多,然而被逆境抑制的m RNA在這些突變子中也更為劇烈的減少。這些結果說明應激顆粒不僅被PKA,HOG等逆境信號通路所調控,并且它也能調節(jié)逆境反應的程度。據推斷,RNA結合蛋白的往復的核質運動負責逆境中的基因表達調控,應激顆粒正是這種核質運動的調控者。逆境下應激顆粒組裝能力強的細胞有生殖能力和適應能力更強的傾向。反之,應激顆粒的缺失可能導致逆境條件下細胞出現(xiàn)過度的有害反應。應激顆粒的組裝可能是細胞對疊加逆境的應激反應減弱的原因之一。此外,本課題還對釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞在衰老過程中產生的損傷蛋白聚集體和應激顆粒進行了對比分析,首先觀察到這兩者之間并不存在共定位關系,進而發(fā)現(xiàn)細胞衰老可以誘導應激顆粒形成,而在其他逆境下衰老細胞應激顆粒的合成被抑制。與應激顆粒相似的是,非逆境條件下衰老細胞的蛋白聚集體豐度高于新生細胞,但逆境下新生細胞中的蛋白聚集體形成率高于衰老細胞,說明細胞衰老對逆境下的蛋白聚集體組裝有抑制作用。
【學位單位】：哈爾濱工業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2015
【中圖分類】：Q933
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第1章 緒論
    1.1 研究的目的和意義
    1.2 國內外研究綜述
        1.2.1 釀酒酵母的合成遺傳陣列技術
        1.2.2 RNA顆粒簡介
    1.3 目前存在的主要問題
    1.4 本文的主要研究內容
第2章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 菌株和質粒
        2.1.2 培養(yǎng)基相關試劑
        2.1.3 實驗主要試劑
        2.1.4 主要實驗設備與用途
    2.2 實驗方法
        2.2.1 質詢菌株的構建
        2.2.2 構建PAB1-RFP單基因敲除陣列
        2.2.3 應激顆粒形成相關基因的大規(guī)模篩選
        2.2.4 篩選結果的驗證
        2.2.5 缺失基因的補回驗證
        2.2.6 熒光顯微鏡成像
        2.2.7 遺傳圖譜的構建
        2.2.8 生物信息學分析
        2.2.9 酵母恢復生長曲線
        2.2.10 逆境后細胞存活率的測量
        2.2.11 CAN1基因突變頻率的測定
        2.2.12 應激性信號蛋白和基因表達水平定量分析
        2.2.13 Western雜交
        2.2.14 酵母菌滴測試
        2.2.15 釀酒酵母世代數(shù)的測定
        2.2.16 衰老細胞的分離純化
        2.2.17 細胞壁芽痕染色
        2.2.18 多聚核糖體含量分析
第3章 應激顆粒形成相關基因的大規(guī)模篩選
    3.1 引言
    3.2 熒光標記應激顆粒組成蛋白PAB1
        3.2.1 應激顆粒組成蛋白Pab1
        3.2.2 PAB1-RFP質詢菌株的構建
        3.2.3 PAB1-RFP在釀酒酵母細胞中的表型
    3.3 標記菌株與釀酒酵母基因組單敲除文庫的融合
    3.4 應激顆粒表型的評價和最適誘導條件的摸索
        3.4.1 應激顆粒表型的評價方法
        3.4.2 大規(guī)模篩選實驗條件探索
    3.5 基于應激顆粒表型的大規(guī)模篩選結果
        3.5.1 應激顆粒的候選陽性與陰性突變子
        3.5.2 候選突變子的檢驗
    3.6 本章小結
第4章 應激顆粒形成相關基因的代謝功能分析
    4.1 引言
    4.2 促進應激顆粒形成的基因功能分布概況
    4.3 轉錄翻譯和RNA代謝對應激顆粒的影響
    4.4 蛋白結構域對應激顆粒的影響
    4.5 細胞中的膜結構對應激顆粒的影響
    4.6 細胞轉運作用對應激顆粒的影響
    4.7 本章小結
第5章 應激顆粒對釀酒酵母的生理影響及作用規(guī)律
    5.1 引言
    5.2 不同逆境對應激顆粒與DNA突變率的影響
        5.2.1 不同逆境引發(fā)不同的應激顆粒發(fā)生率
        5.2.2 逆境下應激顆粒陰性突變子的DNA突變率變化
    5.3 應激顆粒陰性突變子中的信號蛋白表達變化
    5.4 應激顆粒與細胞衰老
        5.4.1 應激顆粒陰性突變子的世代壽命
        5.4.2 衰老細胞中的應激顆粒表型
        5.4.3 RNA顆粒與損傷蛋白聚集體
    5.5 RNA顆粒的形成機理
        5.5.1 mRNP去向決定m RNA命運
        5.5.2 逆境的啟動和終止
    5.6 本章小結
結論
參考文獻
攻讀博士學位期間發(fā)表的論文及其它成果
致謝
個人簡歷

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本文編號：2876742