快速發(fā)展的工業(yè)化和城市化導(dǎo)致重金屬的污染日益嚴(yán)重,這關(guān)系到人類(lèi)健康和環(huán)境安全。被重金屬污染的土壤和水體可通過(guò)農(nóng)業(yè)灌溉進(jìn)入食物鏈并轉(zhuǎn)移到植物和動(dòng)物體內(nèi)。水稻是我國(guó)種植面積最廣的糧食作物,稻田是目前重金屬污染最為嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)區(qū)域。金屬硫蛋白(Metallothionein MT),是一類(lèi)金屬結(jié)合蛋白。自1957年首次在馬腎中發(fā)現(xiàn)以來(lái),研究者們陸續(xù)在不同生物類(lèi)群中展開(kāi)了對(duì)MT的研究,所涉及的領(lǐng)域包括生命科學(xué)、物理化學(xué)、應(yīng)用醫(yī)學(xué)和環(huán)境監(jiān)測(cè)等。MT是細(xì)胞內(nèi)一類(lèi)低分子量、高半胱氨酸含量的蛋白分子,對(duì)具有10個(gè)電子的金屬具有極高的親和力,包括必需金屬(鋅和銅等)和非必需微量元素(鎘和汞等)。MT普遍存在于微生物、植物、動(dòng)物以及人類(lèi)細(xì)胞中,在金屬代謝中起著重要的作用。近年來(lái),對(duì)昆蟲(chóng)MT的研究?jī)H限于果蠅、土壤跳蟲(chóng)、蚊蟲(chóng)等少數(shù)物種,目前很少見(jiàn)對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)MT分子特性及功能方面的系統(tǒng)研究。中華稻蝗(Oxya chinensis, O. chinensis)是以水稻葉片和莖桿為食的重要農(nóng)業(yè)害蟲(chóng),重金屬可通過(guò)中華稻蝗取食富集重金屬的水稻植株后在蟲(chóng)體內(nèi)不同組織中蓄積。本文以重金屬鎘、銅和鋅為脅迫誘導(dǎo)因子,研究重金屬作用下中華稻蝗金屬硫蛋白基因(Oxya chinensis Metallothionein, OcMT)的分子特性和功能以及對(duì)中華稻蝗解毒酶系和組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。本文通過(guò)深入開(kāi)展以上研究,對(duì)闡明中華稻蝗金屬硫蛋白基因功能和重金屬解毒機(jī)制具有重要意義。本文主要內(nèi)容如下：1、中華稻蝗金屬硫蛋白的分子特性分析基于中華稻蝗經(jīng)重金屬鎘染毒后構(gòu)建的數(shù)字基因表達(dá)譜,采用生物信息學(xué)方法系統(tǒng)分析得到2個(gè)OcMT基因(OcMT1和iOcMT2)的全長(zhǎng)序列。已知OcMT1分子全長(zhǎng)552 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?23 bp,編碼40個(gè)氨基酸殘基；OcMT2分子全長(zhǎng)363 bp,開(kāi)放閱讀框?yàn)?95 bp,編碼64個(gè)氨基酸殘基；將這2個(gè)MT基因序列與目前已知的其他昆蟲(chóng)MT序列進(jìn)行比對(duì)和分析,發(fā)現(xiàn)OcMTl和OcMT2具有與其他物種MT蛋白類(lèi)似的氨基酸特征,半胱氨酸(Cys)含量分別為22.5%和25%,這些半胱氨酸在氨基酸分子中以Cys-Cys, Cys-X-Cys, Cys-X-Y-Cys或Cys-X-Y-Z-Cys的結(jié)構(gòu)式存在,這樣的分子組成和特征使半胱氨酸的巰基容易與金屬離子結(jié)合形成M-MT復(fù)合物。2、中華稻蝗金屬硫蛋白基因mRNA轉(zhuǎn)錄特性分析采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了金屬硫蛋白基因在中華稻蝗不同發(fā)育階段和不同組織部位RNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性,結(jié)果表明：OcMT1和OcMT2均在中華稻蝗卵期轉(zhuǎn)錄水平最高,而在孵化后的整個(gè)發(fā)育時(shí)期穩(wěn)定表達(dá),且轉(zhuǎn)錄表達(dá)量較卵期低；OcMTl和OcMT2具有不同的組織分布,OcMT1在視葉中表達(dá)最高,而OcMT2在腦中高表達(dá),其次是脂肪體,表明中華稻蝗2個(gè)OcMT基因在生理功能具有差異性。3、中華稻蝗金屬硫蛋白基因和蛋白功能研究利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)一步從分子水平研究了OcMT1和Oc. MT2的功能,中華稻蝗注射雙鏈RNA (dsRNA)48 h后,用不同濃度的3種金屬處理試蟲(chóng),結(jié)果表明：OcMT1和OcMT2 mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)量在63.1-70.9%的有效沉默時(shí),金屬毒性導(dǎo)致試蟲(chóng)死亡率增加8.5-16.7%；異源表達(dá)OcMT1和OcMT2蛋白的大腸桿菌在含銅培養(yǎng)基的生長(zhǎng)測(cè)試實(shí)驗(yàn)表明,OcMT1和OcMT2蛋白可增強(qiáng)宿主細(xì)菌對(duì)銅的耐受性；采用熒光光譜法檢測(cè)OcM T1和OcMT2蛋白對(duì)不同金屬的結(jié)合能力,結(jié)果表明,異源表達(dá)OcMT1和OcMT2蛋白均可螯合鎘、銅和鋅3種金屬,且OcMT1與鋅的結(jié)合能力最強(qiáng),()cMT2與銅的結(jié)合能力最強(qiáng)。4、重金屬對(duì)中華稻蝗解毒酶活性和組織形態(tài)的影響慢性鎘染毒后中華稻蝗體內(nèi)磷酸酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶等解毒酶活性普遍上升；鎘毒性可導(dǎo)致中腸、胃盲囊、馬氏管以及圍食膜組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損；慢性鎘染毒后中華稻蝗不同類(lèi)型血細(xì)胞形態(tài)和組成發(fā)生變化；中華稻蝗經(jīng)鎘、銅、鋅急性染毒后,發(fā)現(xiàn)蟲(chóng)體脂肪體的脂肪滴直徑變��；馬氏管內(nèi)均出現(xiàn)不同形態(tài)的顆粒物質(zhì)。結(jié)果表明,中華稻蝗相關(guān)組織通過(guò)不同形式參與重金屬的解毒,對(duì)降低重金屬毒性,保護(hù)蟲(chóng)體發(fā)揮重要的作用。綜上所述,本文通過(guò)對(duì)重金屬脅迫下中華稻蝗金屬硫蛋白基因、蛋白、組織形態(tài)和解毒酶變化等系列研究,揭示在重金屬脅迫下蟲(chóng)體基因水平、蛋白水平以及組織學(xué)水平的適應(yīng)性變化規(guī)律。研究結(jié)果對(duì)昆蟲(chóng)重金屬解毒機(jī)制研究具有一定的理論意義,同時(shí)也為檢測(cè)和評(píng)估農(nóng)業(yè)環(huán)境中重金屬的污染和危害提供實(shí)踐依據(jù)。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類(lèi)】：X174;S435.112.4
【部分圖文】：

１９５７年作為錫結(jié)合蛋白被Ｖａｌｌｅｅ和Ｍａｒｇｏｓｈｅｓ在馬腎中發(fā)現(xiàn)由于其分子中富??半脫氨酸且容易與重金屬離子結(jié)合，因此被命名為金屬硫蛋白１４＼科學(xué)家陸續(xù)在??不同的物種中進(jìn)行了大量的研究和探討后發(fā)現(xiàn)其存在于細(xì)菌、植物、無(wú)脊椎動(dòng)物和??脊椎動(dòng)物等幾乎所有的生物體內(nèi)１ＷＷ。因其分子中含有較多數(shù)量的半腕氨酸殘基，使??其分子有較高的硫含量且對(duì)重金屬具有較高的親和力。ＭＴ分子中所含有的半化氨酸??在絕大多數(shù)生物體ＭＴ中是高度保守的，這些半腕氨酸殘基通常配位鍵形成??Ｃｙｓ－Ｘａａ－Ｃｙｓ的排列方式（Ｘａａ是除半脫氨酸Ｗ外的其他氨基酸），其中Ｘ和Ｙ多為??Ｓｅｒ或Ｔｈｒ，其次為Ａｒｇ和Ｌｙｓ。盡管金屬硫蛋白具有一些共有的性質(zhì)和特點(diǎn)，但來(lái)??自不同物種的ＭＴ蛋白質(zhì)的大小和氨基酸組成差別很大，甚至同一物種的不同亞型??間其組成也不盡不同。目前研究最多且較為清楚的是人類(lèi)ＭＴ，人類(lèi)ＭＴ位于第１６??號(hào)染色體且分為４個(gè)類(lèi)型（ｉＷ７，?和Ａ／７Ｖ），Ｍ７和在全身表達(dá)，??特異性的表達(dá)于腦，ｉｌ／風(fēng)則只發(fā)現(xiàn)存在于復(fù)層鱗狀上皮【＂１。??１．２．１金屬硫蛋白的特點(diǎn)??

有樣品中表達(dá)量最化的樣品的表達(dá)量為１，其他各個(gè)樣品的ｍＲＮＡ轉(zhuǎn)錄表達(dá)??１的倍數(shù)，用相對(duì)表達(dá)水平表征。所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析后Ｗ平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，??用Ｔｕｋｅｙ＇ｓ?ＨＳＤ法（ＳＰＳＳ）對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析�；蛳鄬�(duì)表達(dá)量柱形圖上??不同字母代表基因表達(dá)具有顯著性差異（尸＜化〇５），不同數(shù)據(jù)間沒(méi)有顯著性??用相同字母代表。??驗(yàn)結(jié)果??華稻惶金屬硫蛋白基因的驗(yàn)證??研究在前期工作基礎(chǔ)上，采用重金屬領(lǐng)慢性染毒處理中華稻幢后，構(gòu)建數(shù)字??達(dá)譜，分析差異基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，領(lǐng)慢性染毒后有巧９個(gè)基因上調(diào)表??調(diào)表達(dá)基因有１８９個(gè)，其中２個(gè)ＯｃＭＴ基因分別上調(diào)表達(dá)２７９倍和４８３倍。初步分??個(gè)ＯｃＭＴ基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)可能與重金屬領(lǐng)處理中華稻幢有關(guān)。將２個(gè)ＯｃＭＴ基因??Ａ序列輸入Ｇｅｎｂａｎｋ數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Ｂｌａｓｔ分析，并與其他已知昆蟲(chóng)ＭＴ氨基酸序列進(jìn)??，初步判斷２個(gè)基因可能為中華稻幢ＯｃＭＴ基因，因此進(jìn)行了驗(yàn)證和分析。??Ｍａｒｋｅｒ??

ＡＥＯ５０６９９），?岡比亞按蚊：如０ｐ片ｅ／ｅ■ｓ各ｆｌ７Ｋ６／口ｅ（＾ｇＡ／７７：ＡＡＸ８６ＯＯ６，／＾各Ａ／７２：ＡＡＸ８６ＯＯ７），搖蚊：Ｃ／Ｈ＇ｒａＫ〇／Ｋｗ／＊ｚ）�。祝罚罚停�??（ＯＭＴ：ＡＤ巧４１６３），姚妃：描６幻ｍｗｙ口ｏ（Ａｆ７７Ｗ：ＡＢＸ８００７８，Ａ／７７｝＾ＡＡＸ８６０Ｃｒ７９）。??由圖２．４可見(jiàn)，中華稻幢２個(gè)ＭＴ氨基酸（ＯｃＭＴｌ和ＯｃＭＣ）與其他昆蟲(chóng)ＭＴ??的進(jìn)化關(guān)系分析顯示，ＯｃＭＴｌ與家蝸ＭＴ１?Ｗ及黒腹果禍ＭＴＡ聚為一支，而ＯｃＭＴ２??與此的ＭＴＴｙ２聚為另一支。??２．３．２中華稻幢金屬硫蛋白基因序列的分析??將２個(gè)ＯｃＭＴ基因ｃＤＮＡ全長(zhǎng)序列提交ＮＣＢＩ官方網(wǎng)站，并獲得ＧｅｎＢａ址注釋??號(hào)分別為：ＫＪ１５３０１４和ＫＪ１５３０１５。這２個(gè)ＯｃＭＴ基因具有完整結(jié)構(gòu)，包括起始密??碼子ＡＴＧ，終止密碼子ＴＧＡ和ＰＩｏｙＡ尾（ＡＡＴＡＡＡ）。ＯｃＭ？７全長(zhǎng)為５５２?ｂｐ，其開(kāi)??放閱讀框?yàn)椋保玻常猓�，編碼４０個(gè)氨基酸，其蛋白的理論分子大小為３．７４?ＫＤａ，等電點(diǎn)??為?８．１１，分子中含有?１?個(gè)?Ｃｙｓ－Ｃｙｓ?三個(gè)?Ｃｙｓ－Ｘ－Ｃｙｓ?結(jié)構(gòu)（ＣＣＸＸＸＸＸＣＸＸＸＸＣＫＣＸ??－ＸＸＣＴＣＴＮＣＡＣ）；?ＯＣＭＴ２全長(zhǎng)為３６３?ｂｐ

本文編號(hào)：2870066