沙門氏菌是一種危害公眾健康的重要病原體,能引起人和動物食物中毒和急性腸道疾病。隨著沙門氏菌耐藥性增強和耐藥譜的變廣,通過抗生素來預(yù)防和治療沙門氏菌感染越發(fā)困難。據(jù)此,我們建立口服沙門氏菌的小鼠感染模型;對噬菌體對沙門氏菌小鼠感染模型的治療效果進行評估;并對沙門氏菌對噬菌體的抗性機制進行了深入研究。為研究沙門氏菌QH的遺傳進化特點和致病性,對沙門氏菌QH的全基因組進行了比較分析和小鼠感染模型建立。與其他沙門氏菌相比,沙門氏菌QH基因組含有較多的前噬菌體和基因島,其核苷酸和同義密碼子的使用模式表明突變壓力和自然選擇在基因水平上影響了沙門氏菌QH的進化趨勢,而其獨特的密碼子使用模式有助于增強其對環(huán)境的適應(yīng)性和對宿主的致病性。在沙門氏菌QH的感染早期,小鼠外周血中CD4+和CD8+淋巴細胞亞群的水平顯著降低,但一些細胞因子(IFN-β1,IFN-γ和CXCL10)轉(zhuǎn)錄水平的升高可能在抗沙門氏菌感染中具有多種免疫效應(yīng)。此外,小鼠外周血中IL10的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著升高,表明IL10介導(dǎo)的免疫抑制作用可能在口服沙門氏菌QH感染的早期起了重要作用。從國內(nèi)不同地理位置分離了4株烈性沙門氏菌噬菌體,發(fā)現(xiàn)它們都屬于肌尾科并具有相似的生物學特性,與另外2株國內(nèi)的和2株智利的噬菌體具有相似的進化模式�；�4株噬菌體基因組中AT含量GC含量的背景,通過信息熵分析表明整體核苷酸使用偏好是由噬菌體所有的基因決定的。密碼子不同位置核苷酸的使用偏好性要比所有基因的整體核苷酸使用偏好性強(p0.001),而這種遺傳特性直接導(dǎo)致了同義密碼子傾向于A/T結(jié)尾。而噬菌體核苷酸組成約束和自然選擇迫使噬菌體在整體密碼子使用模式方面具有相同的進化趨勢。核苷酸組成約束也在噬菌體同義密碼子使用模式形成過程中起重要作用,包括碼子第1位的keto skew、第2位的嘧啶skew和第3位的AT skew。噬菌體SP1對沙門氏菌QH的吸附速度快,裂解效率高。然而,噬菌體SP1對小鼠感染模型的治療效果不好,雖然通過口服噬菌體SP1一定程度上緩解了小鼠的臨床癥狀,但在持續(xù)的給藥治療過程中,小鼠的脾臟載菌量依然達到3.1×10~5 cfu/mL,我們推測噬菌體治療時間較晚和沙門氏菌QH對噬菌體SP1產(chǎn)生抗性是可能主要原因。我們從沙門氏菌QH中篩選出一株對噬菌體SP1耐受的突變株QHM,噬菌體SP1無法吸附在突變株QHM的表面。沙門氏菌QH脂多糖是噬菌體SP1受體,突變株QHM基因組上與脂多糖合成相關(guān)的rfaJ基因721bp處的堿基從G突變?yōu)門,造成了編碼谷氨酸的密碼子GAG突變?yōu)榻K止密碼子TAG,從而使得糖基轉(zhuǎn)移酶的合成失敗,最終使得突變株QHM的脂多糖結(jié)構(gòu)不完整。為進一步驗證rfaJ基因的功能,我們構(gòu)建了缺失株QHΔrfaJ發(fā)現(xiàn),rfaJ基因敲除后會造成脂多糖結(jié)構(gòu)不完整,噬菌體SP1無法吸附和感染缺失株QHΔrfaJ。最后,通過分析沙門氏菌QH、突變株QHM和噬菌體SP1之間的生長關(guān)系和波動實驗,我們發(fā)現(xiàn),這種抗性機制是通過自然突變產(chǎn)生,與噬菌體SP1無關(guān)。本實驗對沙門氏菌QH及其噬菌體的生物學特性和遺傳進化關(guān)系進行了全面系統(tǒng)的研究;并通過小鼠感染模型及噬菌體治療實驗,對食源性沙門氏菌感染小鼠后引起的免疫應(yīng)答反應(yīng)和噬菌體的治療效果進行了系統(tǒng)的評估;同時,對沙門氏菌對噬菌體的抗性機制進行了深入的研究。為沙門氏菌感染后的噬菌體治療和抗性機制的研究提供了理論依據(jù)。
【學位單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：S852.61
【部分圖文】：

噬菌體SP1與沙門氏菌QH混合作用1 min時,噬菌體SP1開始向沙門氏菌QH聚集,少量的噬菌體SP1吸附沙門氏菌QH表面(圖3-1a);5 min時,大量的噬菌體SP1吸附和包圍在沙門氏菌QH表面(圖3-1b);10 min時,沙門氏菌QH被裂解,并釋放子代噬菌體SP1(圖3-1c)。結(jié)果表明,噬菌體SP1能夠快速的吸附在沙門氏菌QH表面,并且在短時間就能裂解沙門氏菌QH。2.1.2 噬菌體SP1對沙門氏菌QH的裂解效率

在小鼠口服噬菌體3日,對每只小鼠的外周血淋巴細胞亞群進行定量測定發(fā)現(xiàn),與Phage組和Mock組相比,QH組和Treatment組小鼠的外周血中的CD4+細胞亞群有明顯的下降趨勢(圖3-2a);同樣,QH組和Treatment組小鼠的外周血中CD8+細胞亞群也有明顯的下降趨勢(圖3-2b)。2.2.2 小鼠脾臟中細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的變化

通過qRT-PCR測定各組小鼠的細胞因子轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn):QH組和Treatment組與Phage組和Mock組相比,3種IFN轉(zhuǎn)錄水平變化有差異,其中QH組和Treatment組小鼠的IFN-β1和IFN-γ的轉(zhuǎn)錄水平均顯著升高,而IFN-λ2轉(zhuǎn)錄水平顯著降低(圖3-3a);此外IL-10和CXCL10的轉(zhuǎn)錄水平也明顯升高(圖3-3b)。2.2.3 小鼠外周血中細胞因子表達水平的變化
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