近年來(lái),低濃度抗生素殘留在許多動(dòng)物源性食品原料中存在。當(dāng)這些原料被用于生產(chǎn)發(fā)酵食品時(shí),其中殘留的抗生素就會(huì)對(duì)作為發(fā)酵劑的乳酸菌產(chǎn)生一定的脅迫作用。同樣當(dāng)人們?cè)诜每股剡M(jìn)行治療疾病期間,人體內(nèi)的以及外源補(bǔ)充的乳酸菌也會(huì)受到抗生素的脅迫作用。在低濃度的抗生素作用下,為了阻止有害物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi),乳酸菌會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)。此時(shí)會(huì)對(duì)乳酸菌的生理特性和發(fā)酵性能產(chǎn)生怎樣的影響,是否有不良代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生,都需要進(jìn)行深入研究。本論文利用微生物生理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究手段,研究了嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus, S. thermophilus) grx02在低濃度喹諾酮作用下其生理特性、發(fā)酵性能及蛋白組表達(dá)的變化,從而為全面、客觀評(píng)價(jià)乳酸菌的益生特性和安全性提供理論依據(jù)。1.低濃度喹諾酮對(duì)S. thermophilus grx02生理特性的影響測(cè)定了氧氟沙星(Ofloxacin,OFX)和環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin, CPFX)對(duì)S. thermophilusgrx02的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC),然后將S. thermophilusgrx02分別接種于加入0、1/2、1/10和1/50 MIC的OFX和CPFX的MRS液體培養(yǎng)基中,測(cè)定其生長(zhǎng)曲線的變化,分別以光鏡和電鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察,并測(cè)定對(duì)細(xì)胞膜通透性和胞內(nèi)乳糖代謝關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果顯示：S. thermophilus grx02對(duì)OFX和CPFX的最小抑菌濃度分別為7.75μg/mL和3.89μg/mL,均為中度敏感。在1/2MIC的OFX和CPFX作用下,S. thermophilus grx02的生長(zhǎng)速度均顯著降低(P0.05)。在不同亞抑菌濃度的OFX和CPFX作用下,S. thermophilus grx02中的小菌落、微菌落數(shù)明顯增多。通過(guò)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的菌體呈長(zhǎng)橢圓形,而各藥物組的菌體長(zhǎng)度隨著藥物濃度的升高而明顯變短。對(duì)照組的莢膜較厚,比較松散,而藥物組的莢膜明顯的變得薄而致密,將細(xì)胞緊緊包裹住。當(dāng)OFX和CPFX的濃度達(dá)到1/10MIC時(shí),S. thermophilus grx02的細(xì)胞膜通透性就會(huì)顯著降低(P0.05)。當(dāng)OFX和CPFX的濃度達(dá)到1/2 MIC時(shí),S. thermophilus grx02胞內(nèi)的β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶活力均顯著降低(P0.05); 1/50 MIC的OFX對(duì)β一半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶活力的影響不大,1/50MIC的CPFX對(duì)盧一半乳糖苷酶活力影響也不大,但使乳酸脫氫酶活力反而增大。上述結(jié)果表明,在低濃度喹諾酮的作用下,S. thermophilus grx02啟動(dòng)了相應(yīng)的應(yīng)激機(jī)制,其生理特性也發(fā)生了一系列復(fù)雜的變化。2.低濃度喹諾酮對(duì)S. thermophilus grx02發(fā)酵性能的影響研究了不同亞抑菌濃度的喹諾酮對(duì)S. thermophilus grx02的凝乳時(shí)間、產(chǎn)酸能力、產(chǎn)黏能力和蛋白水解能力的影響,以及對(duì)S. thermophilus grx02發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性、流變特性、感官特性、活菌數(shù)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)原料乳中OFX和CPFX的殘留量達(dá)到1/2 MIC,會(huì)使S. thermophilus grx02發(fā)酵乳的脫水收縮性顯著增大,粘附性、膠黏性和咀嚼性顯著降低,蛋白水解能力顯著降低,同時(shí)使S. thermophilus grx02發(fā)酵乳在貯藏期間的活菌數(shù)顯著降低(P0.05)。當(dāng)原料乳中OFX和CPFX的濃度達(dá)到1/10 MIC時(shí),會(huì)延長(zhǎng)Sthermophilus grx02發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間,使S. thermophilus grx02發(fā)酵乳的產(chǎn)酸速率和黏度顯著降低(P0.05),使其在貯藏期間的穩(wěn)定性明顯降低；會(huì)對(duì)S. thermophilus grx02發(fā)酵乳的流變特性產(chǎn)生顯著影響,使其凝膠穩(wěn)定性降低,抗機(jī)械運(yùn)動(dòng)和溫度變化的能力降低；會(huì)對(duì)thermophilus grx02發(fā)酵乳的感官質(zhì)量產(chǎn)生顯著影響,發(fā)酵乳出現(xiàn)了少量乳清析出,且稠厚感變差,其組織狀態(tài)得分顯著低于其他組(P0.05)。當(dāng)OFX和CPFX殘留量達(dá)到1/50 MIC時(shí),會(huì)使發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯降低,主要風(fēng)味化合物雙乙酰類物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也降低,且有機(jī)酸的含量也發(fā)生了明顯的變化。綜合上述研究結(jié)果,我們認(rèn)為用于發(fā)酵乳制品生產(chǎn)的原料乳中OFX和CPFX的殘留限量應(yīng)該控制在1/50 MIC以下。3.低濃度氧氟沙星對(duì)S. thermophilus grx02蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響利用雙向凝膠電泳技術(shù)(2-DE),比較了S. thermophilus grx02分別在空白和龠有1/2MIC OFX的MRS液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期的蛋白質(zhì)組表達(dá)差異,并利川基質(zhì)輔助光解吸／電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對(duì)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定,最后對(duì)差異蛋白的功能分類進(jìn)行了解析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：通過(guò)2-DE得到了背景清晰、分辨率較高、重復(fù)性較好的S. thermophilus grx02的蛋白組圖譜。在1/2MIC OFX作用下訂47個(gè)蛋白點(diǎn)的表達(dá)發(fā)生顯著變化,其中可以鑒定出的蛋白質(zhì)有38個(gè),有5種蛋白質(zhì)在1/2MIC氧氟沙星作用下不表達(dá),其中包括了冷激蛋白CspA、通用應(yīng)激蛋白Gls 39、Fl-ATP合成酶、尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶和硝基還原酶。有30種蛋白質(zhì)表達(dá)發(fā)生了下調(diào),它們分別參與了糖代謝和能量代謝、蛋白質(zhì)的合成、核苷酸的合成、DNA合成、轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)節(jié)等。有3種蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生了上調(diào),均為通用應(yīng)激蛋白。上述結(jié)果表明,1/2MIC的氧氟沙星會(huì)對(duì)S. thermophilus grx02的蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)生顯著地影響,使許多代謝途徑酶的活性受到抑制,從而降低乳酸菌的生長(zhǎng)和代謝速度。同時(shí)誘導(dǎo)一些通用應(yīng)激蛋白表達(dá)的上調(diào),以提高細(xì)胞對(duì)低濃度抗生素的抵御能力。這些都是S. thermophilus grx02抵御低濃度抗生素脅迫的應(yīng)激機(jī)制之一。
【學(xué)位單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：TS201.3
【部分圖文】：

．ｘｆｆ逡逑式中：Ｖａ為反應(yīng)總體積／ｍｋ邋Ｖｆｆ為樣品體積／ｍＬ逡逑ＡＯＤｗｏｕｍ為每分鐘光密度的降低值。逡逑３結(jié)果與分析逡逑３．１幢諾酉同對(duì)＆邋ｆ片ｅｒｗｏｐＭｗ邋ｇｒｘ０２的最小抑菌濃度逡逑最小抑菌濃度（ＭＩＣ）可準(zhǔn)確地反映試驗(yàn)菌株對(duì)抗生素的敏感程度。測(cè)定了公逡逑ｇｒｘ０２對(duì)氧l#沙星的最小抑菌濃度為７Ｊ５邋Ｕ邋ｇ／ｍＬ，對(duì)環(huán)丙沙星的最小抑菌濃３．８９ｕｇ／ｍＬ，參照ＮＣＣＬＳ的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)町說(shuō)明Ｓ祝ｍｗ；７／ｎ７ｗｇｒｘ０２對(duì)氧l#沙星和環(huán)丙均屬于中度敏感。逡逑．３．２不同濃度喧諾酉同對(duì)Ｓ邐ｇｒｘ０２生長(zhǎng)特性白勺影口向逡逑對(duì)照組及分別加入了邋１／２ＭＩＣ、１／１０ＭＩＣ和１／５０ＭＩＣ的ＯＦＸ和ＣＰＦＸ的Ｓ．說(shuō)ｅｒｗｏｐ片！逡逑ｘ０２生長(zhǎng)曲線如圖２－１、圖２－２所示。逡逑．

Ｎ邐、逡逑（ｆ）邋１／５０ＭＩＣ邋ＣＰＦＸ逡逑圖２－３不同濃度哇諾r>作用下Ｓ．邋／Ａｅｗｚｏｐ／ｎ’／ｗ邋ｇｒｘ０２的光鏡（４０0ｘ）照片逡逑Ｆｉｇ．２－３邋Ｓｃａｎｎｉｎｇ邋ｐｈｏｔｏｓ（４０0ｘ）邋ｏｆ邋Ｓ．邋ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ邋ｇｒｘ０２邋ｕｎｄｅｒ邋ｔｈｅ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｑｕｉｎｏｌｏｎｅ逡逑由圖２－３可Ｗ看出，在光學(xué)顯微鏡（４００叫下，對(duì)照組Ｓ．化ｅｎｍ？；加７ｗｇｒｘ０２的菌落呈長(zhǎng)鏈逡逑狀，聚集在一起，而不同濃度的ＯＦＸ和ＣＰＦＸ作用下，Ｓ．化ｅｒｗｏｐＭｗｇｒｘ０２普遍形成，其中逡逑１／２ＭＩＣ組的最為明顯，有許多分散的單個(gè)菌落。說(shuō)明有亞抑菌濃度的抗生素存在時(shí)，會(huì)逡逑對(duì)／／ｚｅｒｗｏ如化ｇｒｘ０２的細(xì)胞產(chǎn)生一定刺激作用，使得細(xì)胞表面的相互吸附能力被破壞，逡逑從而分散成小菌落和微菌落。逡逑２．３．３．２透射電子顯微鏡下的觀察結(jié)果逡逑不同濃度ＯＦＸ和ＣＰＦＸ作用下的＆從ｅｎｗｏｐＷ／ｗ邋ｇｒｘ０２電子顯微鏡拍攝照片如圖２－４所示。逡逑

表３－２y乳時(shí)間測(cè)定結(jié)果（ｈ）逡逑了ａｂｌｅ邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｍｅａｓｉｎ邋ｅｄ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｃｕｒｄ邋ｔｉｍｅ邋（邋ｈ邋）逡逑唾諾哪濃度邐氧氮沙星邐環(huán)丙沙星逡逑對(duì)照組邐４．０邐４．０逡逑１／２ＭＩＣ邐５．５邐６．０逡逑１／１０ＭＩＣ邐４．５邐４．５逡逑１／５ＱＭ１Ｃ邐＾邐４＾邐逡逑由表３－ｌ可Ｗ看出，當(dāng)ＯＦＸ和ＣＰＦＸ的殘留量為ｌ／１０ＭＩＣ和ｌ／２ＭＩＣ時(shí)，＆／／＾ｍ７ｗ如リｗ逡逑ｇｒｘ０２發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間均比對(duì)照組和１巧０邋ＭＩＣ組明顯延長(zhǎng)，而＾５０邋ＭＩＣ組與對(duì)照組凝乳時(shí)逡逑間相同。說(shuō)明當(dāng)氧l#沙星和環(huán)丙沙星的質(zhì)量濃度達(dá)到１／１０邋ＭＩＣ時(shí)，就會(huì)對(duì)乳酸晵的生長(zhǎng)產(chǎn)逡逑生一定的抑制作用，使其產(chǎn)酸的明顯速度降低，從而延長(zhǎng)發(fā)酵乳的凝乳時(shí)間。逡逑３．３．３不同濃度喧諾酉同對(duì)Ｘ邐片術(shù)＂ｇｒｘ０２產(chǎn)黏能力的影口向逡逑在發(fā)酵及４’Ｃ儲(chǔ)賊期間各發(fā)酵乳樣品的黏度變化如圖３－３、３－４所示。逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2820196