【摘要】：近十幾年來,基于基因密碼子擴(kuò)展的非天然氨基酸(UAA)技術(shù)得到了廣泛的應(yīng)用。通過這項技術(shù),我們可以實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)UAA特異性地插入到目標(biāo)蛋白的任意位點(diǎn),其應(yīng)用范圍非常廣闊,包括原核生物——細(xì)菌,真核生物——酵母、哺乳動物細(xì)胞、真核生物體(如線蟲)、高等植物(如擬南芥)等。利用這種方法已經(jīng)有超過100種的UAA被基因編碼到不同的系統(tǒng)中,利用UAA本身的性質(zhì)以及UAA與蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)了多種多樣的用途,如蛋白的位點(diǎn)特異性標(biāo)記,具有生物學(xué)意義的核磁、紅外、FRET、熒光探針,改造并提高蛋白的酶活,向蛋白的特定位點(diǎn)引入翻譯后修飾研究其功能等。UAA插入蛋白的特異性翻譯系統(tǒng)依賴于吡咯賴氨酸氨酰tNRA合成酶(Py1RS)底物結(jié)合口袋對UAA的特異性識別作用,我們將底物結(jié)合口袋的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)突變,構(gòu)建了Py1RS的突變庫,通過正負(fù)篩選的策略篩選出能夠識別目標(biāo)UAA的氨酰tRNA合成酶,然后利用正交翻譯系統(tǒng)將UAA插入到需要研究的蛋白的特定位點(diǎn),進(jìn)一步研究蛋白的性質(zhì)或結(jié)構(gòu)的變化。 C02的生物固定是地球上的生命賴以生存的基礎(chǔ),rubisco是固碳開爾文循環(huán)第一步反應(yīng)中起催化作用的酶,同時也是固碳的限速步驟。其蛋白結(jié)構(gòu)中存在一個重要的翻譯后修飾——carbamate lysine(Kcx),起著固定并激活Mg2+的作用。我們首次通過UAA的方法研究了這一翻譯后修飾的功能,并希望能夠提高rubisco的酶活,進(jìn)而提高光合作用的效率,達(dá)到增加糧食產(chǎn)量的目的。首先我們設(shè)計了一系列Kcx的結(jié)構(gòu)類似物,通過引入苯酯保護(hù)或光保護(hù)的羧基保護(hù)基策略,找到了能夠識別此UAA的Py1RS突變體,并且成功將Kcx結(jié)構(gòu)類似物插入了rubisco蛋白的189位點(diǎn),以模擬Kcx的作用。結(jié)果表明含有此Kcx結(jié)構(gòu)類似物的rubisco活性幾乎全部喪失,這說明Kcx對于rubisco的功能是不可或缺的,其側(cè)鏈上氨基的作用可能比之前預(yù)想的更加重要。 甲�；嚢彼崾且环N新的翻譯后修飾,廣泛存在于真核生物染色體的組蛋白中。這種翻譯后修飾可能對于染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的調(diào)控具有重要作用,但并未得到詳細(xì)的研究,原因之一在于缺乏位點(diǎn)特異性地將甲�；嚢彼嵋胩囟ǖ鞍椎姆椒�。我們首次通過人工篩選的方法進(jìn)化出了能夠識別甲酰賴氨酸的Py1RS克隆,通過基因密碼子擴(kuò)展的方法將甲酰賴氨酸引入到了組蛋白H3的特定位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞中甲酰賴氨酸密碼子的擴(kuò)展。另外,我們測試了抗體對于乙酰賴氨酸和甲酰賴氨酸識別的異同,發(fā)現(xiàn)識別乙酰賴氨酸的抗體不識別甲酰賴氨酸,這表明兩種翻譯后修飾可能存在功能上的差異。我們的研究為開展甲酰賴氨酸翻譯后修飾功能的研究提供了強(qiáng)有力的工具,對于組蛋白表觀遺傳學(xué)的研究具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q517;Q78

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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2 孫逸;硫氧還蛋白f介導(dǎo)的煙草Rubisco活化酶氧化還原調(diào)控的初步研究[D];上海師范大學(xué);2013年

3 陳曉;小麥葉片中與Rubisco大亞基降解相關(guān)的蛋白酶的生化特性、合成定位及分離純化研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

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5 范昊坤;5，5-二甲基乙內(nèi)酰脲二聚體的合成及晶體結(jié)構(gòu)[D];廣西大學(xué);2013年

6 崔艷軍;鹽脅迫下紫花苜蓿蛋白質(zhì)組分析及耐鹽相關(guān)基因克隆[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

7 彭知云;沒食子兒茶素電子等排體的合成及抑制尿素酶活性研究[D];吉首大學(xué);2013年

8 吳倩;CAT調(diào)控水稻葉片光呼吸過程中抗氧化系統(tǒng)的機(jī)理研究[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

9 張振良;玉米Rubisco活化酶基因的克隆與表達(dá)分析[D];揚(yáng)州大學(xué);2013年

10 孟祥龍;黃瓜葉片線粒體交替氧化酶途徑在不同光溫條件下介導(dǎo)的光破壞防御作用[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2817943