發(fā)布時間：2020-09-05 11:17

　　 昆蟲擁有一個在進化上保守的先天免疫系統(tǒng)來識別和消滅入侵的病原微生物。而腸道屏障是昆蟲先天免疫的第一道防線,為了抵御病原微生物的感染,昆蟲腸道形成了一套完整的免疫應(yīng)答體系。盡管在昆蟲腸道中通過基因組、蛋白質(zhì)組的同源序列比對或者直接與病原微生物結(jié)合的方法鑒定到了多個免疫相關(guān)分子,但是對于昆蟲腸道免疫應(yīng)答的機制以及未知的腸道免疫分子的了解還是有限的。因此,本文的目的就是通過新的方法來鑒定家蠶(Bombyx mori)腸道中未知的免疫相關(guān)分子并且進一步研究它們參與免疫應(yīng)答的分子機制。本研究為了進一步鑒定新的家蠶腸道免疫相關(guān)分子,構(gòu)建了家蠶中腸T7噬菌體cDNA展示文庫,并且利用不同的生物學(xué)配體如幾丁質(zhì)(Chitin)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、黑胸敗血芽胞桿菌(Bacillus bombyseptieus,Bb)以及沙雷氏菌(Serratia marcescens,Sm)等對所構(gòu)建的噬菌體展示文庫進行生物學(xué)淘選。并進一步對所淘選到的分子進行生物學(xué)驗證以及對其參與腸道免疫應(yīng)答的機制進行揭示。獲得的主要結(jié)果如下:1.構(gòu)建家蠶中腸cDNA T7噬菌體展示文庫以及配體結(jié)合多肽的淘選構(gòu)建了家蠶中腸cDNA T7噬菌體展示文庫,插入片段大小在300 bp-2000 bp之間,文庫原始滴度為1×105 pfu/m L,擴增后的滴度為8×1010 pfu/m L,文庫重組率為96%,重組子中大約有57%的插入片段大于250 bp。用幾丁質(zhì)、脂多糖、黑胸敗血芽胞桿菌和沙雷氏菌為配體淘選噬菌體展示文庫,獲得了多個免疫相關(guān)候選蛋白,如翻譯控制的腫瘤蛋白、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、氨肽酶N、真菌蛋白酶抑制劑F以及β葡聚糖識別蛋白等。其中在用上述四種不同配體淘選的時候都能獲得翻譯控制的腫瘤蛋白,說明該蛋白可能參與對上述幾種配體的識別。2.細胞水平上鑒定家蠶TCTP的免疫功能免疫組化和Western blotting結(jié)果顯示,TCTP由腸道細胞合成并分泌到腸腔中,但不能穿透圍食膜進入腸液。另外,血淋巴中也檢測到少量TCTP的存在。微生物感染家蠶,腸道可溶性TCTP呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。血細胞吞噬實驗結(jié)果表明,TCTP能與微生物結(jié)合,促進血細胞對微生物的吞噬,起著調(diào)理素的作用。另外,TCTP可以誘導(dǎo)家蠶Bm Ns細胞產(chǎn)生抗菌肽,用ERK抑制劑U0126和PD098059能抑制TCTP誘導(dǎo)家蠶細胞產(chǎn)生抗菌肽,且具有劑量依賴效應(yīng)。家蠶細胞瞬時干涉ERK后,TCTP不能誘導(dǎo)其產(chǎn)生抗菌肽。ERK磷酸化抗體免疫印跡結(jié)果顯示,TCTP能誘導(dǎo)家蠶細胞ERK發(fā)生動態(tài)磷酸化的變化,且在5 min磷酸化水平最高,持續(xù)到10 min,之后逐漸降低,30 min降到起始水平。3.個體水平上驗證家蠶TCTP的免疫功能成功構(gòu)建了家蠶中腸TCTP轉(zhuǎn)基因干涉載體,獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因干涉品系。通過q RT-PCR和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)與正常大造相比,轉(zhuǎn)基因干涉家蠶的中腸TCTP無論在轉(zhuǎn)錄水平還是翻譯水平都得到了有效干涉。對轉(zhuǎn)基因家蠶添食致病微生物后,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因干涉中腸TCTP的家蠶抗菌肽不能被誘導(dǎo)上調(diào)表達,且家蠶存活率降低。用磷酸化的ERK抗體免疫印跡結(jié)果顯示,正常大造感染微生物后ERK會發(fā)生磷酸化的動態(tài)變化,而轉(zhuǎn)基因干涉中腸TCTP的家蠶添食微生物后,ERK的磷酸化水平比較低,且在感染的前12 hr呈現(xiàn)一直下降的趨勢,12 hr后有升高的趨勢。綜上所述,轉(zhuǎn)基因干涉家蠶中腸TCTP感染微生物后,擾亂了ERK磷酸化的動態(tài)變化,導(dǎo)致抗菌肽的產(chǎn)生下降,并進一步降低了家蠶的存活率。
【學(xué)位單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q966
【部分圖文】：

圖 1.1 果蠅體液免疫應(yīng)答模式圖[9]Fig 1.1 Schematic diagram of humoral immune response in Drosophila.2 昆蟲局部性免疫應(yīng)答所謂局部性免疫應(yīng)答是指發(fā)生在器官表皮的免疫反應(yīng)，包括外表

圖 1.2 果蠅局部免疫應(yīng)答模式圖[20]Fig 1.2 Schematic diagram of local immune response in Drosophila1.3 家蠶分子免疫研究進展我國栽桑養(yǎng)蠶已有幾千年的悠久歷史，蠶桑產(chǎn)業(yè)也成為我國經(jīng)濟發(fā)展的主要

圖 1.3 TCTP 和 Mss4 的結(jié)構(gòu)比較[54]Fig 1.3 Fold of TCTP and comparison with Mss4a，b，TCTP 的結(jié)構(gòu)；c，d，Mss4 的結(jié)構(gòu)。a，c 相同的顏色代表相似的結(jié)構(gòu)。b，d 紅色代表兩個蛋白結(jié)構(gòu)的差異區(qū)域。of TCTP. c,d, Fold of Mss4. Panels (a) and (c) are colored to show the common core of the tw

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本文編號：2812955