耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans)是現(xiàn)有已知生物中對(duì)氧化性脅迫具有超強(qiáng)抗性的物種之一。胞內(nèi)代謝和很多理化效應(yīng)(如紫外輻射、電離輻射、干燥、過氧化氫等)產(chǎn)生的活性氧都可引起氧化性脅迫。至今,對(duì)耐輻射異常菌極端氧化性抗性分子調(diào)控機(jī)制的了解不是十分清楚,尤其是胞內(nèi)游離氨基酸對(duì)極端氧化抗性作用缺乏認(rèn)識(shí)。本論文從耐輻射異常球菌全局調(diào)控蛋白Irr E入手,開展紫外輻射脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄組分析,研究Irr E對(duì)胞內(nèi)有關(guān)氨基酸代謝基因的影響,著重分析了Lrp家族丙氨酸脫氫酶調(diào)控蛋白Ald R(DR_1894)的作用。研究進(jìn)展如下:1.Irr E作為全局調(diào)控蛋白,其突變導(dǎo)致菌株對(duì)輻射氧化高度敏感,轉(zhuǎn)錄組分析顯示,在正常和UV輻射處理以后Irr E使得92個(gè)基因顯著上調(diào)和86個(gè)基因顯著下調(diào)(變化2倍以上,P≤0.05)。根據(jù)COG分類這些基因分為3類:信息的存儲(chǔ)和處理、代謝以及少有研究的,其中DNA損傷修復(fù)相關(guān)的基因ppr A、ddr B、ddr A、ddr D、mut S、mut L、ruv B等顯著下調(diào)。另外,Irr E突變引起了氨基酸代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化,如dr_0958和dr_0959(peptide ABC transporter permease),dr_0965和dra0127(GMC oxidoreductase)以及dr_1895(ald,編碼丙氨酸脫氫酶)。RT-PCR分析驗(yàn)證ald基因等的表達(dá)顯著下調(diào),這說明Irr E可能會(huì)影響胞內(nèi)丙氨酸的代謝。2.為了研究Irr E對(duì)細(xì)胞內(nèi)氨基酸代謝的影響,利用HPLC的方法測(cè)定了irr E突變株不同脅迫沖擊下胞內(nèi)的游離氨基酸含量,正常生長(zhǎng)條件下,野生型和irr E突變株胞內(nèi)游離氨基酸總含量分別為40.6±1.7和39.1±3.9 mg/g干細(xì)胞,熱激后分別為40.2±4.0和36.8±0.3,UV處理后分別為19.5±0.3和22.2±1.4以及H2O2處理后為38.7±2.9和38.5±1.0,其中含量較高的谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸等發(fā)生了不同程度的變化,如正常生長(zhǎng)條件下,野生型和irr E突變株胞內(nèi)游離丙氨酸含量分別為6.4±0.2和5.8±0.7,UV處理后分別為3.3±0.1和4.3±0.3。以上結(jié)果表明Irr E影響了胞內(nèi)氨基酸代謝,參與了丙氨酸代謝的調(diào)控。3.初步研究發(fā)現(xiàn)ald基因的表達(dá)可能直接受DR_1894蛋白的調(diào)控。為了研究DR_1894的功能,我們首先運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析,結(jié)果表明DR_1894蛋白屬于典型的Lrp家族調(diào)控蛋白,與下游基因ald可能構(gòu)成基因簇,具有Mycobacterium smegmatis丙氨酸脫氫酶調(diào)控蛋白Ald R特性。RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同脅迫(高溫、重金屬、H2O2,冷、UV)條件下,ald R基因的表達(dá)表現(xiàn)了不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)。脅迫抗性分析發(fā)現(xiàn)ald R突變株對(duì)紫外、干燥、低溫等理化脅迫的抗性與野生型一致,但是對(duì)于過氧化物(過氧化氫異丙苯,過氧化氫)敏感,存活率要比野生型低1-2個(gè)數(shù)量級(jí)。RT-PCR結(jié)果顯示過氧化氫沖擊后,ald R突變株中一些氧化抗性基因表達(dá)量下調(diào),如oxy R、sod C、kat E、osm C、grx等。結(jié)果表明Ald R對(duì)耐輻射異常球菌的氧化抗性具有重要作用。4.為進(jìn)一步探究Ald R與ald之間的調(diào)控關(guān)系,我們利用Biolog方法、特定培養(yǎng)基利用丙氨酸實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)ald R突變株對(duì)丙氨酸的利用能力弱于野生型。同時(shí)在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)到穩(wěn)定期時(shí),ald R突變株菌體的干重小于野生型。啟動(dòng)子分析發(fā)現(xiàn)ald啟動(dòng)子中含有Ald R的可能結(jié)合的反向重復(fù)區(qū)域CGCAACCGCGTTGCG。通過β-半乳糖苷酶活性的測(cè)定,ald啟動(dòng)子活性在ald R突變株中要比在野生型中的活性低3倍左右。另外我們發(fā)現(xiàn)ald R突變株對(duì)氯化鈉和山梨醇抗性弱于野生型,也說明了ald R的突變會(huì)影響胞內(nèi)滲透保護(hù)物質(zhì)丙氨酸的含量。最后我們利用HPLC測(cè)定了不同條件下ald R突變株的游離氨基酸的含量,發(fā)現(xiàn)突變株中丙氨酸的含量確實(shí)發(fā)生了發(fā)生了變化。上述研究結(jié)果表明Ald R調(diào)控ald基因的表達(dá),影響了胞內(nèi)丙氨酸含量。總之,Irr E作為全局調(diào)控因子影響了耐輻射異常球菌的胞內(nèi)代謝,特別是丙氨酸代謝。耐輻射異常球菌的氨基酸代謝(丙氨酸代謝)影響了其極端的脅迫抗性,但是具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：Q937

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本文編號(hào)：2810457