【摘要】：背景:肺癌是威脅人類生命健康最大的惡性腫瘤之一。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段缺乏對其早期檢測和篩選的有效方法。人們在分子水平上對肺癌的認(rèn)識(shí)明顯不足,這就迫切需要通過尋找肺癌的新分子特征和靶點(diǎn)來改進(jìn)診斷方法并最終達(dá)到靶向治療。許多有效的抗癌藥物已從自然資源中開發(fā)。大多數(shù)抗癌藥物都來自動(dòng)植物的次生代謝產(chǎn)物和其它小分子化合物。然而,近年來生物大分子的活性引起了研究人員的廣泛關(guān)注。蚯蚓纖溶酶(EFE)在體外和體內(nèi)都對肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性。此外,來自云芝CM-101菌株的一種糖蛋白在體內(nèi)體外都表現(xiàn)出了顯著的抗腫瘤活性。此外,天花粉蛋白——I型核糖體失活蛋白,可抑制多種腫瘤細(xì)胞株的生長并誘導(dǎo)凋亡。香菇是世界第二大食用菌,同時(shí)也是我國特產(chǎn)之一。香菇隸屬于擔(dān)子菌綱,傘菌目,口蘑科,香菇屬。香菇含有高蛋白、低脂肪、多糖、多種氨基酸和多種維生素,是一種名貴的食藥兩用真菌,在民間素有山珍之王之稱。香菇中含有的香菇多糖可以提高機(jī)體的免疫力。香菇中的水提取物對體內(nèi)的過氧化氫有一定的消除作用,在一定程度上也起到延緩衰老的作用。除此之外,香菇對糖尿病,肺結(jié)核,傳染性肝炎,神經(jīng)炎,便秘,降血壓,降膽固醇,降血脂等起治療作用,又可預(yù)防動(dòng)脈硬化,肝硬化等疾病。我課題組自1990年開始,根據(jù)當(dāng)時(shí)國際針對香菇藥用價(jià)值研究,采用生物工程發(fā)酵技術(shù)對6株香菇進(jìn)行菌絲發(fā)酵,發(fā)現(xiàn)一株經(jīng)發(fā)酵后其發(fā)酵液具有直接抗腫瘤作用,因該菌株于1991年3月開始研究,故命名為“C91-3”,“C”表示“China”�；诎l(fā)酵液中的一些蛋白組分在體內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)中表明具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力,我課題組對香菇C91-3菌株轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了高通量測序,獲得了大量的Unigene及其功能注釋信息。其中Unigene為28923條,具有編碼框的Unigene有18120條。根據(jù)基因功能注釋初步結(jié)果,利用在線工具軟件Sanger Pfam進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,從Unigene序列中篩選出凋亡相關(guān)基因Latcripin-13。根據(jù)Latcripin-13轉(zhuǎn)錄組序列設(shè)計(jì)引物,用3′-Full RACE(Rapid Amplificatioon of c DNA Ends,RACE)、5′-Full RACE方法獲得Latcripin-13基因編碼序列(Coding Sequence,CDS)。目前,我們已經(jīng)完成了Latcripin-13基因編碼序列在Gen Bank上的序列注冊(Accession Number:KF682439)。目的:通過構(gòu)建p ET-32a(+)表達(dá)載體將香菇C91-3菌株凋亡相關(guān)蛋白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Rosetta-gami(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),同時(shí)對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。通過誘導(dǎo)表達(dá)香菇C91-3菌株凋亡相關(guān)蛋白Latcripin-13功能域,研究其對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能影響,探討其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制,為將其開發(fā)成為新型抗腫瘤藥物提供依據(jù)。方法:(1)提取香菇C91-3菌株菌絲體總RNA,參照轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果,通過3'-Full RACE、5'-Full RACE方法獲得Latcripin-13基因編碼序列。經(jīng)生物信息學(xué)軟件分析該蛋白的氨基酸組成和理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域。(2)設(shè)計(jì)特異性引物,利用RCR技術(shù)獲得Latcripin-13功能域序列并將其基因克隆到原核表達(dá)載體p ET32a(+)中,構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒p ET32a(+)-truncated-latcripin-13,將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),用SDS-PAGE及Western blot方法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。用鎳柱親和層析的方法進(jìn)行分離純化并用BCA法測定蛋白濃度。用尿素梯度透析的方法對目的蛋白進(jìn)行復(fù)性,并用圓二色光譜的方法對復(fù)性后的蛋白進(jìn)行鑒定。(3)Latcripin-13功能域抗腫瘤活性的鑒定:MTT(Methyl Thiazoly Ltetra Zolium,MTT)法測定其對人肺腺癌A549細(xì)胞的增殖抑制率;用FITC標(biāo)記Latcripin-13功能域,并用熒光顯微鏡觀察其在A549細(xì)胞中的定位;用電鏡法檢測其對A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響;用33258染色法檢測觀察其對A549細(xì)胞凋亡的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測其對A549細(xì)胞的凋亡作用及細(xì)胞周期的影響;JC-1的方法檢測其對A549細(xì)胞線粒體膜電勢的影響;用分光光度法檢測其對caspase-3,-8,-9酶活性的影響;用Western blot的方法檢測Bcl-2,Bax,CCD1,CDK4,NF-κB,GSK3β,p-GSK3β表達(dá)水平的變化。結(jié)果:(1)利用RACE方法獲得了Latcripin-13基因編碼序列。通過對Latcripin-13氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白三級結(jié)構(gòu)含有染色體濃縮調(diào)節(jié)子(RCC1)和植物同源結(jié)構(gòu)域(PHD)。(2)應(yīng)用PCR技術(shù)獲得了latcripin-13功能域基因片段,通過Bam HⅠ和XhoⅠ雙酶切驗(yàn)證插入p ET32a(+)中的片段為latcripin-13功能域基因片段。SDS-PAGE和Western blot結(jié)果證明蛋白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中成功誘導(dǎo)表達(dá)。利用親和層析的方法將其成功純化,圓二色光譜驗(yàn)證結(jié)果顯示其復(fù)性成功。(3)MTT法檢測結(jié)果顯示,Latcripin-13功能域作用于A549細(xì)胞呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間的依賴關(guān)系(P0.05);熒光顯微鏡觀察其確實(shí)進(jìn)入A549細(xì)胞,并分布在細(xì)胞核周圍;電鏡的結(jié)果顯示該蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡,并呈現(xiàn)出早期凋亡的基本現(xiàn)象;33258染色結(jié)果顯示,該蛋白確實(shí)能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,并呈現(xiàn)出核碎裂和染色體皺縮等凋亡現(xiàn)象;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,100μg/ml該蛋白誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出時(shí)間依賴關(guān)系,同時(shí)100μg/ml BSA對照組對A549無顯著凋亡的作用;細(xì)胞周期檢測結(jié)果顯示,Latcripin-13功能域蛋白對A549細(xì)胞產(chǎn)生G0/G1期阻滯作用。JC-1結(jié)果顯示,隨著Latcripin-13功能域蛋白作用濃度的增加,線粒體膜電勢發(fā)生改變;分光光度法結(jié)果顯示,100μg/ml該蛋白作用于A549細(xì)胞時(shí),caspase-3,-8,-9被活化;Western blot結(jié)果顯示,隨著Latcripin-13功能域蛋白作用濃度的增加,Bax/Bcl-2比值增加(p0.05),GSK3β/p-GSK3β比值增加(p0.05),NF-κB,CCD1,CDK4表達(dá)量降低。結(jié)論:(1)根據(jù)香菇C91-3菌株的轉(zhuǎn)錄組序列,成功篩選出凋亡相關(guān)基因Latcripin-13,并成功獲得Latcripin-13基因編碼序列。(2)成功獲得Latcripin-13功能域片段序列;重組質(zhì)粒p ET32a(+)-truncated-latcripin-13成功構(gòu)建;目的蛋白Latcripin-13功能域在大腸桿菌Ecoli.Rosetta-gami(DE3)中成功表達(dá);蛋白Latcripin-13功能域通過親和層析成功純化;包涵體蛋白Latcripin-13功能域經(jīng)尿素梯度透析成功復(fù)性。(3)Latcripin-13功能域蛋白進(jìn)入人肺腺癌A549細(xì)胞系并對其具有誘導(dǎo)凋亡作用,其可能通過細(xì)胞周期G1期阻滯,NF-κB途徑和線粒體途徑共同作用其凋亡。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2

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本文編號：2797613