【摘要】：衰老是生物界的普遍現(xiàn)象,是人體組織器官功能失衡的漸變過程,而在這一衰老事件干細(xì)胞起到了重要作用,干細(xì)胞在身體分布廣泛,為機(jī)體的組織修復(fù)和自我更新提供細(xì)胞來源,因此當(dāng)人體內(nèi)干細(xì)胞出現(xiàn)老化會引發(fā)整個(gè)機(jī)體衰老。已有研究證明,細(xì)胞微環(huán)境與干細(xì)胞的衰老有密切聯(lián)系,當(dāng)微環(huán)境出現(xiàn)變化可直接影響干細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、衰老。目前,間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stemcells,MSCs)作為一種重要的成體干細(xì)胞受到了越來越多的關(guān)注。因取材方便、易于分離,低免疫原性,多向分化潛能優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于細(xì)胞治療和組織工程領(lǐng)域。同樣也與機(jī)體的衰老密切相關(guān)。然而關(guān)于微環(huán)境與MSCs衰老之間的調(diào)控還不是很清楚,有些報(bào)道顯示可能與抑癌基因異常表達(dá)有關(guān)。近年研究證實(shí)抑癌基因LKB1在細(xì)胞內(nèi)通過調(diào)節(jié)AMPK參與體細(xì)胞代謝,其自身的去極化可被長壽基因SIRT1調(diào)控。近年nature報(bào)道LKB1在HSC穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等方面起著重要作用,但其在衰老干細(xì)胞中的調(diào)節(jié)功能及作用機(jī)制還不是很清楚。因此,本文你擬研究微環(huán)境對MSCs衰老的影響,明確LKB1調(diào)控的衰老的分子機(jī)制,進(jìn)而為干細(xì)胞老化和衰老相關(guān)疾病治療起到積極的意義。本課題中我們分別通過組織塊種植法、組織絞碎法、膠原酶消化法、梯度密度離心法從臍帶、胎盤、骨髓、脂肪中分離出MSCs,流式檢測顯示四種MSCs均表達(dá)CD90,CD105,CD73;不表達(dá)CD11b,CD19,CD34,CD45,HLA-DR。在合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基作用下,四種MSCs均具有成脂、成骨和成軟骨分化潛能。本研究中我們應(yīng)用不同時(shí)段血清FBS、CS長期培養(yǎng)MSCs,進(jìn)一步明確在不同血清微環(huán)境下MSCs增殖、分化、凋亡的改變,以及衰老相關(guān)基因表達(dá)已明確微環(huán)境調(diào)控MSCs衰老的分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),FBS組MSCs的增殖和分化能力要優(yōu)于CS組,而細(xì)胞的凋亡比率、p53等衰老相關(guān)基因的表達(dá)水平要低于CS組。我們的結(jié)果說明FBS能夠?qū)SCs的生長提供一個(gè)更好的微環(huán)境,有助于保持其生物學(xué)特性,延緩衰老,而CS則會加速細(xì)胞的衰老進(jìn)程,可能的機(jī)制是衰老相關(guān)基因的異常表達(dá)和MSCs分泌細(xì)胞因子(如IL-6,IL-8)的變化有關(guān)。除此以外,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用PH值測定儀和冰點(diǎn)滲透壓儀,調(diào)配PH值為6.5、7、7.5的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,滲透壓為300mOsm和350mOsm的間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,體外擴(kuò)增MSCs,明確在不同酸堿、滲透壓微環(huán)境作用下MSCs功能活性的變化,并通過real-time PCR檢測衰老相關(guān)基因p53、p21、p16、AMPK、LKB1的表達(dá)變化情況。結(jié)果表明檢測在PH值為6.5,滲透壓為350mOsm時(shí)的微環(huán)境培養(yǎng)MSCs可誘導(dǎo)其出現(xiàn)老化及分化功能增強(qiáng)。為進(jìn)一步研究間充質(zhì)干細(xì)胞衰老,我們應(yīng)用H2O2、高糖、阿霉素三種誘導(dǎo)劑制備MSCs衰老模型,同時(shí)檢測它們對MSCs形態(tài)、增殖、分化等衰老表征的影響。成功篩選出并證明H2O2誘導(dǎo)衰老模型是高效而穩(wěn)定。通過該模型我們比較了年輕、年老MSCs中的衰老基因p16,p21,p53以及l(fā)KB1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)伴隨細(xì)胞衰老它們表達(dá)增強(qiáng)。當(dāng)不同微環(huán)境作用下誘導(dǎo)MSCs衰老和分化的同時(shí),LKB1表達(dá)是逐漸增強(qiáng),衰老相關(guān)基因的表達(dá)也高表達(dá),為明晰LKB1調(diào)控衰老MSCs的分子機(jī)制,我們重點(diǎn)檢測了信號通路中的關(guān)鍵分子AMPK與GSK3表達(dá)變化。結(jié)果表明LKB1通過AMPK磷酸化促進(jìn)MSCs衰老,此外,高表達(dá)LKB1也通過磷酸化GSK-3介導(dǎo)wnt信號通路,促進(jìn)β-catenin蓄積影響MSCs老化進(jìn)程。本研究表明,LKB1磷酸化下游靶蛋白AMPK與GSK3在MSCs衰老中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用,可為MSCs衰老提供新的研究思路,并為延緩機(jī)體衰老提供新的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：北京工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R339.38
【圖文】：

23 E圖 2-1 臍帶、胎盤、骨髓和脂肪來源的 MSCs 細(xì)胞形態(tài) (1003)Fig 2-1 MSCs from different tissue origin（1003）（A,B）UC-MSCs,(C) PD-MSCs,(D)BM-MSCs,(E) AD-MSCs.

圖 2.3 四種來源 MSC 的增殖能力檢測Fig 2.3 The proliferation potential of MSC.（p>0.05）.4.4 MSCs 成脂、成骨和成軟骨分化在本部分實(shí)驗(yàn)中，我們分別對臍帶、胎盤、骨髓和脂肪四種組織來源的 MSCs行分化能力驗(yàn)證，結(jié)果表明四種來源 MSCs 均具有三系分化能力，但在分化的效上略有差異，如圖 2.4 所示。AD-MSCs 經(jīng)成脂誘導(dǎo) 5-7 天即可看見明顯的滴生成。BM-MSCs 則需要 10-12 天左右，分化時(shí)效略低于脂肪源 MSCs;C-MSCs 和 PD-MSC 需要兩周才可誘導(dǎo)成為脂肪細(xì)胞。BM-MSCs 向成骨、成骨方向分化最為容易，誘導(dǎo) 15-18 天左右，經(jīng)茜素紅染色可顯示有明顯的鈣結(jié)出現(xiàn)，成軟骨的甲苯胺藍(lán)染色陽性明顯，AD-MSCs、UC-MSCs、PD-MSC 次。

圖 2-4 四種來源的 MSCs 成脂、成骨、成軟骨分化（2003）Fig 2-4 The adipogenic, osteogenic and Chondrogenic differentiation of MSCs from fourdifferent tisuue origin（2003）.2.4.5 臍血與胎盤 HSC 比較我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測了胎盤源和臍血來源的單個(gè)核細(xì)胞中 CD34+細(xì)胞比例，結(jié)果詳見表 2-1,2-2。結(jié)果表明胎盤源單個(gè)核細(xì)胞中總 CD34+細(xì)胞比例略低于臍帶血，而 CD34+CD38-細(xì)胞亞群比例高于臍血。此外，胎盤源單個(gè)核細(xì)胞數(shù)明顯高于臍血約為 7-10 倍，因此胎盤源 CD34+細(xì)胞和 CD34+CD38-細(xì)胞數(shù)，分別較臍血高 4-8 倍。說明胎盤血較臍血含有更多的造血干細(xì)胞，可用于臨床造血干細(xì)胞移植，提供了一個(gè) HSC 的新來源。表 2-1 胎盤血和臍血源 CD34+細(xì)胞及其亞群細(xì)胞比例(%)Table 2-1The percentage of CD34+cells in the human placenta and umbilical cord blood

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 魯揮,何憲平;衰老的研究與進(jìn)展[J];中等醫(yī)學(xué)教育;2000年S1期

2 張波,劉承蕓,孟紫強(qiáng);復(fù)制衰老的分子生物學(xué)進(jìn)展[J];生命科學(xué)研究;2002年S1期

3 肖政華;張光奇;;衰老的分子基因水平研究[J];貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2006年03期

4 楊發(fā)亮;房冬梅;鄒銀平;;淺析運(yùn)動(dòng)延緩衰老的機(jī)制[J];內(nèi)江科技;2011年10期

5 王福龍;王甄真;陳雁;;衰老的分子機(jī)制與干預(yù)研究的最新進(jìn)展[J];中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào);2012年08期

6 孫明德;鄭集;;衰老的起因和機(jī)制[J];生理科學(xué)進(jìn)展;1981年02期

7 吳鏡海;;人類生理衰老生物學(xué)[J];海南大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);1985年03期

8 Roy A K;汪義和;;各種衰老理論的評價(jià)[J];國外醫(yī)學(xué)(老年醫(yī)學(xué)分冊);1986年04期

9 陳禮湘;老年生理(1)[J];護(hù)士進(jìn)修雜志;1992年01期

10 劉俊達(dá);衰老和老年病的分子機(jī)理[J];老年學(xué)雜志;1993年06期

相關(guān)會議論文 前10條

1 朱漢民;;衰老的生物指標(biāo)[A];中國營養(yǎng)學(xué)會第三屆老年?duì)I養(yǎng)暨第二屆營養(yǎng)與腫瘤學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];1994年

2 傅文慶;;衰老及其治療[A];老齡問題研究論文集（七）[C];2005年

3 童坦君;張宗玉;王文恭;;衰老相關(guān)基因研究進(jìn)展[A];老齡問題研究論文集（十一）——積極老齡化研究之三[C];2006年

4 任利群;;衰老與心血管疾病[A];第十屆全國老年醫(yī)學(xué)進(jìn)展學(xué)術(shù)會議暨江蘇省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會老年分會學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2010年

5 姚軍孝;毛忠南;王建文;汪海燕;毛立亞;張曉凌;張恩育;;中醫(yī)對衰老的認(rèn)識和中醫(yī)藥抗衰老機(jī)制研究[A];甘肅省中醫(yī)藥學(xué)會2013年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2013年

6 彭小冬;張宗玉;童坦君;;衰老相關(guān)p21~(WAF1)的高表達(dá)并非與p53無關(guān)[A];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)會第八屆會員代表大會暨全國學(xué)術(shù)會議論文摘要集[C];2001年

7 姚軍孝;毛忠南;王建文;汪海燕;毛立亞;張曉凌;張恩育;;中醫(yī)對衰老的認(rèn)識和中醫(yī)藥抗衰老機(jī)制研究[A];全國針灸臨床適宜技術(shù)推廣研討會暨甘肅省針灸學(xué)會2013年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2013年

8 姜明紅;項(xiàng)洋;張亞璽;劉士廉;劉彥信;鄭德先;;miRNA在免疫衰老中的調(diào)控機(jī)制研究[A];遺傳學(xué)與社會可持續(xù)發(fā)展——2010中國青年遺傳學(xué)家論壇論文摘要匯編[C];2010年

9 呂曉鳳;蔣曉剛;白俊海;毛澤斌;;IGFBP-3基因在衰老細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控研究[A];第七屆全國老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨海內(nèi)外華人老年醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2004年

10 謝肖立;吳s

本文編號：2763076