【摘要】：鐵是植物生長和發(fā)育必需的基本元素,在多種細(xì)胞反應(yīng)過程中扮演重要角色包括光合作用,呼吸作用,葉綠素合成及DNA合成等。在葉綠體中,鐵是光合作用電子傳遞鏈的必需成分,是超氧化物歧化酶的輔助因子。因此鐵穩(wěn)態(tài)對于葉綠體及植物生長發(fā)育都是至關(guān)重要的。本研究克隆了煙草NtPIC1基因,通過過表達及RNAi手段,研究了NtPIC1在煙草鐵代謝中的作用。分析了轉(zhuǎn)NtPIC1基因煙草對其他重金屬的響應(yīng),尤其是NtPIC1-OX轉(zhuǎn)基因煙草對于Cd脅迫的耐受性。主要研究結(jié)果如下:1.利用RT-PCR技術(shù)克隆了煙草NtPIC1基因全長cDNA,NtPIC1定位在葉綠體膜上,Southern blot鑒定該基因在煙草基因組中為單拷貝基因。在根、莖、葉、花中均表達,經(jīng)酵母鐵缺失突變體fet3fet4功能互補實驗證明,NtPIC1具有鐵轉(zhuǎn)運功能。2.構(gòu)建了RNAi植物表達載體pRNAi-NtPIC1和過表達植物表達載體pBI121-NtPIC1。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法,將NtPIC1基因?qū)霟煵菁?xì)胞核基因組中。通過PCR,q RT-PCR檢測及Southern blot檢測,獲得NtPIC1-RNAi轉(zhuǎn)基因植株和NtPIC1-OX過表達轉(zhuǎn)基因植株。3.NtPIC1-RNAi和NtPIC1-OX植株的葉綠體鐵含量及葉綠素含量顯示:NtPIC1-RNAi植株表現(xiàn)為失綠癥,葉片白化,植株矮小,葉綠體鐵含量缺乏、葉綠素含量下降并且葉片的葉綠體及其中的類囊體膜嚴(yán)重降解。而NtPIC1-OX植株的葉片呈現(xiàn)深綠色,與WT相比葉片含有高水平的葉綠素含量及葉綠體鐵含量。NtPIC1-OX植株的葉綠體中類囊體緊實堆疊,其中還有很多光合作用產(chǎn)物淀粉顆粒。4.通過qRT-PCR分析了NtPIC1-RNAi和NtPIC1-OX植株的鐵代謝相關(guān)基因的表達量。結(jié)果表明與WT相比轉(zhuǎn)基因植物(NtPIC1-RNAi和NtPIC1-OX)的鐵轉(zhuǎn)運基因,鐵氧化脅迫基因,鐵硫蛋白合成基因的表達量發(fā)生改變,說明NtPIC1影響了植物的鐵穩(wěn)態(tài)。5.通過釀酒酵母野生型BY4741轉(zhuǎn)化空載體pYES及轉(zhuǎn)化基因pYES-NtPIC1,轉(zhuǎn)化酵母在含有不同金屬的培養(yǎng)基中培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)隨著酵母稀釋濃度的增加,與轉(zhuǎn)空載體pYES相比,轉(zhuǎn)pYES-NtPIC1酵母在含金屬Ni,Cu,Co的培養(yǎng)基上長勢更弱,說明轉(zhuǎn)pYES-NtPIC1酵母對這些金屬更加敏感,而在含重金屬Cd的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)pYES-NtPIC1酵母生長的更好,說明異源表達NtPIC1對重金屬Cd有更強的耐受性。6.Cd脅迫下,通過觀察WT植株與NtPIC1-OX植株生長表型,發(fā)現(xiàn)NtPIC1-OX植株有更高的鮮重量及更長的主根,與WT植株相比,過表達植株的根長抑制率也更低。經(jīng)過Cd脅迫,WT植株比NtPIC1-OX植株葉片更加黃化且植株矮小。測量地上及地下部分的鐵和鎘含量發(fā)現(xiàn),NtPIC1-OX植株根部鐵含量比WT植株低,但地上部分鐵含量高于WT植株,說明NtPIC1-OX植株地下向地上的鐵轉(zhuǎn)運能力更強。而NtPIC1-OX植株的根部和地上部分Cd含量則顯著少于WT植株。7.qRT-PCR分析了在正常MS及Cd脅迫條件下NtPIC1-OX和WT植株中與金屬轉(zhuǎn)運相關(guān)基因的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在NtPIC1-OX植株中,地上部分鐵轉(zhuǎn)運基因NtPIC1,根部的NtNRAMP1和NtFER1與WT植株相比顯著上調(diào)表達,說明NtPIC1-OX植株地上部分的鐵含量較高,可能依靠這些基因上調(diào)表達實現(xiàn)的。鐵代謝相關(guān)基因NtFRO1,NtIRT1及NtZIP1,同時也是Cd轉(zhuǎn)運體的這些基因,在NtPIC1-OX植株根部顯著下調(diào)表達,說明NtPIC1-OX植株中Cd的吸收和累積量較少可能依賴于這些基因的下調(diào)表達實現(xiàn)的。8.通過分析抗氧化指標(biāo)測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),在正常培養(yǎng)基MS和含有Cd脅迫培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件下,NtPIC1-OX植株的抗氧化酶SOD,POD,CAT活性均顯著高于WT植株,而MDA含量顯著低于WT植株。研究結(jié)果表明,在Cd的脅迫下,過表達NtPIC1是一種有效的方式來增加地上部分鐵含量以提高Cd脅迫下植株抗氧化損傷的能力。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2

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1 龔勛;煙草葉綠體透性酶NtPIC1基因的克隆及其功能研究[D];哈爾濱師范大學(xué);2015年

本文編號：2753044