【摘要】：第一部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、培養(yǎng)和生物學(xué)特性研究 目的；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有無限增殖能力和多向分化潛能,在特定的條件下可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等多種中胚層來源組織細(xì)胞,MSCs可用于臨床治療股骨頭壞死、脊髓損傷、免疫相關(guān)疾病。本研究旨在探討成人骨髓MSCs分離、純化、培養(yǎng)及鑒定的方法,觀察其向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化過程中形態(tài)學(xué)特征,檢測(cè)在成骨分化過程中Runx2基因的表達(dá)情況和成脂分化過程中PPAR-Y基因的表達(dá)情況。 方法：無菌環(huán)境下抽取人股骨近端骨髓,采用密度梯度離心聯(lián)合差異貼壁法分離骨髓MSCs,體外擴(kuò)增和傳代培養(yǎng),使用計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行記數(shù)統(tǒng)計(jì),流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記CD34、CD45、CD90的表達(dá)情況。MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)人骨髓MSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化,觀察形態(tài)學(xué)改變。并采用RT-PCR和Western blot方法檢測(cè)在分化過程中Runx2和PPAR-γ的動(dòng)態(tài)表達(dá)。 結(jié)果：原代和傳代細(xì)胞呈紡錘狀外觀,生長(zhǎng)增殖能力良好,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈成“S”形,細(xì)胞表面抗原標(biāo)記物CD90呈陽性表達(dá),CD34和CD45呈陰性表達(dá)。經(jīng)定向誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞分別呈現(xiàn)成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的表型特征。在成骨誘導(dǎo)分化過程中,RT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,Runx2的表達(dá)也明顯增加,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。同樣,經(jīng)定向成脂誘導(dǎo)分化后,細(xì)胞分別呈現(xiàn)脂肪的表型特征,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,PPAR-γ的表達(dá)也明顯增加,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 結(jié)論：該方法能從人骨髓中高效分離和擴(kuò)增MSCs,生物學(xué)性狀穩(wěn)定,具有向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能,能為骨組織工程提供理想的種子細(xì)胞。 第二部分激素性股骨頭壞死患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)目、功能及分化能力變化的相關(guān)研究 目的：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrow mesenchymal stem cells, MSCs)成骨成脂分化的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)維持人體內(nèi)骨代謝穩(wěn)態(tài)起著重要作用。在激素的干預(yù)下,骨代謝平衡被打破,進(jìn)而產(chǎn)生異常的生理生化反應(yīng),最終演變發(fā)展為股骨頭壞死。本文旨在研究激素性股骨頭壞死患者M(jìn)SCs的數(shù)目、功能和成脂成骨分化能力是否改變,并探討氧化應(yīng)激在分化過程中的作用。 方法：選取2012年9月-2013年12月就診32例激素性股骨頭壞死患者,21例外傷性股骨頸骨折患者。經(jīng)患者書面同意和武漢協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)審批后,在手術(shù)室無菌條件下抽取患者股骨骨髓10ml。經(jīng)密度梯度離心貼壁法體外分離、培養(yǎng)MSCs,取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用10μM谷胱甘肽對(duì)股骨頭壞死組MSCs進(jìn)行干預(yù),比較各組MSCs的集落形成能力,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、細(xì)胞成骨和成脂分化能力以及關(guān)鍵因子的表達(dá)水平。 結(jié)果：激素性股骨頭壞死組MSCs與股骨頸骨折組相比較,集落形成能力顯著下降,活性氧水平顯著升高(P0.05),谷胱甘肽干預(yù)后,集落形成能力升高,活性氧水平水平下降,與壞死組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。誘導(dǎo)分化染色結(jié)果顯示,激素性股骨頭壞死組MSCs成骨分化能力低于股骨頸骨折組,而成脂分化能力高于股骨頸骨折組,谷胱甘肽干預(yù)組較股骨頭壞死組成骨能力增強(qiáng)而成脂能力減弱。PCR和western blot結(jié)果表明,激素性股骨頭壞死組Runx2、ALP的表達(dá)水平顯著低于股骨頸骨折組(P0.05),谷胱甘肽干預(yù)后能上調(diào)Runx2、ALP的表達(dá)(P0.05)。PPAR-γ、C/EBP的表達(dá)情況恰好相反。 結(jié)論：激素性股骨頭壞死患者M(jìn)SCs數(shù)量和功能均下降,細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高,成骨能力下降,成脂能力增強(qiáng)。谷胱甘肽可以通過降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平逆轉(zhuǎn)這種變化。 第三部分谷胱甘肽在激素性股骨頭壞死骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能失調(diào)中的作用 目的：細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的異常增加是激素性股骨頭壞死的重要原因,本研究的目的是評(píng)估抗氧化劑谷胱甘肽對(duì)激素誘導(dǎo)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)活性氧水平和成脂成骨關(guān)鍵因子表達(dá)水平的影響。 方法：用10μM的地塞米松處理人MSCs,模擬激素性股骨頭壞死細(xì)胞模型,用不同濃度(5μ M,10μM,50μM)谷胱甘肽的對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),共5個(gè)組分別為：正常組(A組),激素誘導(dǎo)組(B組),5μM谷胱甘肽干預(yù)組(C組),10μM谷胱甘肽干預(yù)組(D組),50μM谷胱甘肽干預(yù)組(E組),在細(xì)胞培養(yǎng)7d后,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平,real-time PCR和western bolt技術(shù)檢測(cè)成骨成脂關(guān)鍵基因表達(dá)的水平,在細(xì)胞培養(yǎng)21后,油紅0染色觀察細(xì)胞成脂分化情況。 結(jié)果：激素誘導(dǎo)21d,油紅0染色顯示,MSCs出現(xiàn)明顯的成脂分化。激素誘導(dǎo)7d,流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平增加,經(jīng)谷胱甘肽干預(yù)后,細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平下降；real-time PCR和western bolt結(jié)果顯示成脂轉(zhuǎn)錄因子PPAR-γ、C/EBP水平明顯升高,成骨轉(zhuǎn)錄因子RUNX2、ALP水平明顯下降(P0.05)。在谷胱甘肽干預(yù)后,細(xì)胞內(nèi)PPAR-γ、C/EBP水平降低,RUNX2、ALP表達(dá)水平升高。10μM谷胱甘肽組(D組)和50μM谷胱甘肽組(E組)作用最明顯,和5μM谷胱甘肽組(C組)比較,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 結(jié)論：谷胱甘肽可以通過降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平抑制人MSCs向成脂分化,增強(qiáng)成骨分化。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2728428