發(fā)布時間：2020-03-15 00:05

【摘要】：木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的生物降解研究具有重要的生物學(xué)和工業(yè)應(yīng)用意義。對木質(zhì)纖維素降解酶系進行組成優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)改造,對促進木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)生物燃料和大宗化產(chǎn)品具有重要價值。草酸青霉(Penicillium oxalicum)作為一種重要的產(chǎn)纖維素酶工業(yè)微生物,和里氏木霉相比具有酶系組成和比例更加合理、半纖維素酶活力更高的優(yōu)點。目前已有的草酸青霉木質(zhì)纖維素降解酶系在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)生物乙醇中仍然存在用量大、成本高的問題。找到能夠促進纖維素降解的關(guān)鍵酶組分、降低生產(chǎn)成本是提高木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化經(jīng)濟性的關(guān)鍵途徑之。本論文的主要研究結(jié)果如下:1.草酸青霉木質(zhì)纖維素降解酶庫的構(gòu)建及其成員的酶學(xué)性質(zhì)研究通過同源、異源方式表達了 12種木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶,構(gòu)建成一個小型的草酸青霉木質(zhì)纖維素降解酶庫。其中纖維素酶有2種,半纖維素酶有8種,此外還有2個輔助酶。測定了部分酶庫成員的比酶活、最適溫度、最適pH、溫度穩(wěn)定性以及pH耐受性。外源添加β-葡萄糖苷酶能夠顯著提高草酸青霉高產(chǎn)菌株JU-A10-T酶系對工業(yè)廢渣木糖渣的糖化能力,從而減少了達到同等水解效率時酶的用量。2.添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D等半纖維素酶對預(yù)處理木質(zhì)纖維素底物降解的促進作用添加α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶Abf43D和內(nèi)切-β-1,4-甘露聚糖酶Man5A可以明顯促進草酸青霉酶系降解水熱法預(yù)處理的玉米芯和木糖渣時的葡萄糖產(chǎn)量。進一步探究Abf43D促進纖維素降解的機理發(fā)現(xiàn),用Abf43D預(yù)處理能夠提高底物的轉(zhuǎn)化率,推測其能夠通過除去底物中木聚糖側(cè)鏈上的阿拉伯呋喃糖基,從而打破糖化中的抗降解屏障,與內(nèi)切-β-1,4-木聚糖酶Xyn1OA等協(xié)同促進半纖維素的降解,并有利于纖維素酶對纖維素的水解,最終提高了葡萄糖產(chǎn)量。此外Abf43D的添加能夠緩解木聚糖水解液對纖維二糖水解酶活力的抑制作用。3.添加醛糖酸內(nèi)酯酶AltA對木質(zhì)纖維素糖化中β-葡萄糖苷酶活力和葡萄糖產(chǎn)量的影響D-葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯對β-葡萄糖苷酶活力有強烈的抑制作用。添加AltA能緩解D-葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯對β-葡萄糖苷酶活力的抑制。向糖化體系中添加AltA,不僅能提高草酸青霉和里氏木霉酶系的β-葡萄糖苷酶活力,還能促進纖維素的降解。通過HPLC-ESI-Q-TOF MS分析,證實了當(dāng)AltA存在時糖化體系內(nèi)的D-葡萄糖酸-1,5-內(nèi)酯水平顯著降低。當(dāng)添加疊氮化鈉和金屬離子螯合劑EDTA抑制氧化還原酶類活性后,AltA的增效作用明顯減小。4.裂解性多糖單加氧酶-醛糖酸內(nèi)酯酶-β-葡萄糖苷酶(LPMO1-AltA-BGL1)協(xié)同體系降解木質(zhì)纖維素研究及其組分配比的優(yōu)化證實了 LPMO1-AltA-BGL1體系能夠協(xié)同降解磷酸膨脹纖維素,并可促進商業(yè)纖維素酶降解微晶纖維素和多種預(yù)處理的木質(zhì)纖維素類底物。糖化體系中存在AltA時,內(nèi)酯含量下降、β-葡萄糖苷酶活力上升,說明AltA緩解了可能由LPMO1產(chǎn)生的內(nèi)酯對BGL1的抑制,從而使協(xié)同體系進一步發(fā)揮效果。利用Design Exβert軟件設(shè)計了混料實驗并預(yù)測了優(yōu)化方案,得到LPMO1、AltA和BGL1的最優(yōu)配比約是3:8:14。
【圖文】：

纖維素進一步鑲嵌在一個半纖維素、果膠和木素的基質(zhì)中（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ邋ａｎｄ逡逑Ｂｅｒｍｅｋ２００９），其中木素和半纖維素位于初級和次級細(xì)胞壁的微纖維間隙中和中逡逑膠層中（圖１－１）。逡逑＾ＯＨ邐＾ＯＨ邐戶邋ＯＨ逡逑９邋各。／邋ｖ４。／逡逑ＯＨ邐ＯＨ邐ＯＨ逡逑ｐ－Ｃｏｕｍａｒｙｌ邋ａｌｃｏｈｏｌ邋Ｃｏｎｉｆｅｒｙｌ邋ａｌｃｏｈｏｌ邋Ｓｉｎａｐｙｉ邋ａｌｃｏｈｏｌ逡逑＠邋：栙．盧，、y’逡逑ｆ邐Ｍａｃｒｏｆｉｂｒｉｌ逡逑貸：．Ｖ興皆逡逑Ｐｅｎｔｏｓｅ邐．邐＇邐—逡逑Ｈｅｘｏｓｅ：＾＾＾逡逑。８＂。＇。５６逡逑Ｃｕ邋打邋ｅｎｔ邋ＯｐＷｏｎ邋ｉｎ邋bq邋０！說邋ｈｎｏｌｏｇｙ逡逑圖１－１木質(zhì)纖維素的多層次結(jié)構(gòu)模型（Ｍｅ巧ａｎｄ民ａｇａｕｓｋａｓ邋２０１４）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｍｕｌｔｉ－ｌａｙｅｉ＊ｅｄ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．逡逑與纖維素相比，半纖維素?fù)碛懈鄻拥慕M成和結(jié)構(gòu)。半纖維素包括木聚糖、逡逑甘露聚糖、半乳聚糖和阿拉伯聚糖等聚合物（Ｂｅｇｅｔ邋ａｌ．邋２００１）。半纖維素中主要的逡逑聚糖類型如表１－１所示。自然界中含量最豐富的半纖維素是木聚糖，其主鏈由Ｐ－Ｄ－逡逑２逡逑

圖１－２酶解纖維素示意圖。ＥＧ斷開纖維素鏈，為ＣＢＨ提供更多可作用的缺口。ＣＢＨ嘛uQＨ逡逑ＩＩ分R%沿著纖維素的還原端和非還原端進行性水解出纖維二糖單元。纖維二糖又被ＢＧ水解逡逑成葡萄糖巧ｅｒｌｉｎ邋２０１３）。逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏ打邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ．邋ＥＧｓ邋ｃｌｅａｖｅ邋化ｅ邋ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ｃｈａｉｎｓ邋化邋ｇｅｎｅｒａｔｅ逡逑ａｐｐｒｏａｃｈａｂｌｅ邋ｅｎｄｓ邋ｆｏｒ邋ＣＢＨｓ－邋ＣＢＨ邋Ｉ邋ａｎｄ邋ＣＢＨ邋ＩＩ邋ｃｌｅａｖｅ邋ｃｅｌ山ｌｏｓｅ邋ｉｎ邋ａ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｅ邋ｍａｎｎｅｒ，逡逑ｒｅｌｅａｓｉｎｇ邋ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ邋ｆｒｏｍ邋ｒｔｉｅ邋ｉ＊ｅｄｕｃｉｎｇ邋ａｎｄ邋ｎｏｎ－ｒｅｄｕｃｉｎｇ邋ｔｅｒｍｉｎｕｓ邋ｏｆ邋ｌ；ｈｅ邋ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ邋ｃｈａｉｎ，，逡逑ｉ＊ｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．邋Ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ邋ｉｓ邋ｔｈｅｎ邋ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ邋ｉｎｌ；ｏ邋ｇｌｕｃｏｓｅ邋ｂｙ邋目Ｇ．逡逑１．２．２半巧維素巧逡逑目前木質(zhì)纖維素生物質(zhì)中半纖維素組分的有效利用尚未達到葡萄糖的水平，逡逑因此在一定程度上削弱了木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化技術(shù)的競爭力（Ｗｙｍａｎ邋１９９９）。將半逡逑纖維素生物轉(zhuǎn)化成可酵解糖是實現(xiàn)生物藝醇商業(yè)化生產(chǎn)的重要一步。酶解法是一逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q936

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本文編號：2587073