【摘要】：S-腺苷蛋氨酸(SAM)是由意大利人Cantoni于1953年發(fā)現(xiàn)的。它廣泛存在于各種生物體內(nèi),參與體內(nèi)40多種生化反應(yīng),在蛋白質(zhì)、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、磷脂質(zhì)和維生素的合成過(guò)程中起著重要作用。S-腺苷蛋氨酸是一種重要的代謝中間體,對(duì)機(jī)體代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行起著至關(guān)重要的作用。SAM是由底物L(fēng)-甲硫氨酸(L-Met)和腺苷三磷酸(ATP)在S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-Adenosyl-L-Methionine Synthetase, EC 2.5.1.6)作用下合成的。SAM目前主要用于醫(yī)藥行業(yè),在臨床醫(yī)學(xué)上表現(xiàn)出優(yōu)秀的應(yīng)用價(jià)值,可用于肝臟、神經(jīng)系統(tǒng)、骨關(guān)節(jié)炎、性功能障礙及癌癥等疾病的治療。目前生產(chǎn)SAM主要有微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶促轉(zhuǎn)化法�；瘜W(xué)合成法分離純化困難,成本高；微生物發(fā)酵法是目前SAM的主要生產(chǎn)方法,主要是酵母細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)SAM,但是分離純化工藝復(fù)雜,生產(chǎn)周期長(zhǎng)；酶促轉(zhuǎn)化法是目前生產(chǎn)SAM的研究熱點(diǎn),與其他兩種方法相比,酶促轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)時(shí)間短、轉(zhuǎn)化率高、分離純化容易、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。但由于生物體內(nèi)SAM合成酶含量比較低、酶活不高,且穩(wěn)定性較差,所以克隆出過(guò)表達(dá)、酶活高、穩(wěn)定性好的SAM合成酶是酶促轉(zhuǎn)化法合成SAM的關(guān)鍵。本論文以大腸桿菌(Escherichia Coli)、嗜熱菌(Thermus thermophilus)基因組為模板擴(kuò)增出SAM合成酶基因MetK、MATTt,以質(zhì)粒pET22b (+)為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒,以大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主菌構(gòu)建高產(chǎn)SAM的重組菌,實(shí)現(xiàn)了SAM合成酶的高效表達(dá),并對(duì)培養(yǎng)條件、反應(yīng)條件及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究；針對(duì)嗜熱菌來(lái)源的SAM合成酶MATTt進(jìn)行了固定化研究,將其固定在了碳納米管上并對(duì)固定化后的SAM合成酶進(jìn)行了表征；嗜熱來(lái)源的MATTt進(jìn)行了酶分子結(jié)晶及其結(jié)構(gòu)解析,初步揭示了其熱穩(wěn)定的機(jī)理,為酶法生產(chǎn)SAM提供了有價(jià)值的參考。本論文具體研究?jī)?nèi)容如下：1、以大腸桿菌染色體DNA為模板,擴(kuò)增得到SAM合成酶基因metK。將所得基因整合到載體pET22b (+),利用T7強(qiáng)啟動(dòng)子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄,以E.coli BL21 (DE3)為表達(dá)菌株,構(gòu)建出了具有高效表達(dá)SAM合成酶的基因工程菌,實(shí)現(xiàn)了SAM合成酶基因在大腸桿菌中過(guò)表達(dá),計(jì)算得metK酶的酶活為33.42 U/L(相對(duì)于發(fā)酵液體積),是空質(zhì)粒酶活的123.70倍。對(duì)metK酶進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化：最適碳源為乳糖,最適氮源為尿素；誘導(dǎo)劑IPTG添加量為0.25‰,誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600值為0.5左右,誘導(dǎo)時(shí)間為6小時(shí)。優(yōu)化了該酶的反應(yīng)條件：最適反應(yīng)溫度為70℃；最適緩沖液(即pH值)為pH值8.0的Tris-HCl緩沖液；最適離子為Mg2+離子：最適酶量為催化10mmol/L的ATP和L-Met時(shí),需要的最適酶量為4g/L; ATP為此酶促反應(yīng)的主要抑制性底物。對(duì)酶熱穩(wěn)定性進(jìn)行了研究：該酶在70℃保存5小時(shí),酶活力保留80%左右,當(dāng)保存15小時(shí)時(shí),酶活力只存留15%左右,到25小時(shí)迅速下降至5%左右,保存30小時(shí)后幾乎沒(méi)有酶活。研究了酶動(dòng)力學(xué)參數(shù),結(jié)果Vmax為0.07 mM/min, ATP的Km值為4.13mM, L-Met的Km值為2.20mM。2、構(gòu)建了來(lái)源于嗜熱菌(Thermus thermophilus HB27)的含SAM合成酶基因的重組質(zhì)粒pET22b-MATTt。在E.coli-B121(DE3)中實(shí)現(xiàn)了SAM合成酶基因MATTt的過(guò)表達(dá),并用鎳柱親和層析純化了該酶。計(jì)算得MATTt酶的比酶活為120.5 U/g,酶活為12.70 U/L。研究了MATTt的酶學(xué)性質(zhì)：MATTt酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)表明結(jié)果Vmax為0.84μmol/min/mg, ATP的KM 4.19 mM, L-Met的KM為1.2 mM,與來(lái)源于Thermococcus Kodakarensis的同為嗜熱SAM合成酶的TkMAT相似。結(jié)構(gòu)穩(wěn)定是該酶最突出特點(diǎn)。由圓二色譜圖得出MATTt酶在pH值為5-10之間,結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。熱穩(wěn)定性方面,70℃條件下保持24小時(shí),酶活幾乎沒(méi)有損失。保存36小時(shí)后酶活仍保留60%�？疾炝薓ATTt的最適反應(yīng)條件。該酶在較廣的溫度范圍內(nèi).(30℃到90℃C)表現(xiàn)出催化活性。酶活隨著反應(yīng)溫度的升高而升高,在80℃催化活性表現(xiàn)最高；MATTt在緩沖液pH值為6-11之間有活性,pH值為8.0時(shí)活性最大；發(fā)現(xiàn)該酶對(duì)Zn2+顯示離子偏好性。應(yīng)用功能化改造的多壁碳納米管(MWCNTs)為載體對(duì)嗜熱來(lái)源的SAM合成酶MATTt進(jìn)行固定化,催化SAM合成。并對(duì)固定化酶進(jìn)行表征。經(jīng)過(guò)固定化MATTt酶經(jīng)過(guò)4批次反應(yīng)酶活保留80%。3、確定了MATTt蛋白的多個(gè)結(jié)晶條件,獲得了可用于X射線衍射的MATTt蛋白晶體,并運(yùn)用分子置換法解析其結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)MATTt與metK的結(jié)構(gòu)比較,發(fā)現(xiàn)二者的主要區(qū)別在于之前報(bào)道的‘'disordered loop"上,與大多數(shù)結(jié)構(gòu)不同的是,MATTt中這段loop區(qū)的密度很好,其中的氨基酸殘基可以全部確認(rèn)。從目前已經(jīng)解析的結(jié)構(gòu)來(lái)看,MATTt的這段loop無(wú)論與metK這段完整的結(jié)構(gòu)或有缺陷的結(jié)構(gòu)相比,都存在著較為明顯的構(gòu)象差異,由此推測(cè)這段區(qū)域極有可能是二者熱穩(wěn)定性不同的主要原因。
【圖文】：

動(dòng)力學(xué)研巧思示，，環(huán)的開(kāi)放運(yùn)動(dòng)只有１0’２秒，比化學(xué)反應(yīng)時(shí)的變化要快１０逡逑倍。運(yùn)用定點(diǎn)旋轉(zhuǎn)標(biāo)記方法對(duì)環(huán)與底物的關(guān)系進(jìn)斤研究，結(jié)果證明：環(huán)的運(yùn)動(dòng)是蛋白逡逑質(zhì)的固有性質(zhì)而不是嚴(yán)格的配體調(diào)節(jié)，模擬空間結(jié)構(gòu)如圖１－６所示。逡逑姦逡逑Ｄ１０７ＲＩ邐？邋＊邋＊戶、心＾邋／朵逡逑＇忽詩(shī)媭p浩�，辶x稀鰣危懾巍義稀我澹義賢跡保跺澹櫻粒禿銑紗啄Ｄ飪占浣峁雇煎義希疲椋紓保跺澹櫻椋恚酰歟幔簦椋錚鑠澹錚駑澹螅穡幔悖邋澹螅簦潁酰慊潁邋澹媯錚蟈澹櫻粒灣澹螅恚瑁澹簦幔螅邋義希保矗車鞍字世嘉峁寡芯垮義銜爍徊降牧私猓櫻粒禿銑擅傅淖饔沒(méi)恚疚畝運(yùn)婕暗模櫻粒禿銑衫業(yè)鞍族義轄锪死嘉峁溝牟舛�，主要采用�?shù)线晶体讶O浞∣喍愿玫鞍字實(shí)模任⑻褰峁菇義閑脅舛�。下面将对各种蛋白肿R(shí)峁共舛ê馱げ獾姆椒ń芯嚀遄凼觥ｅ義希保矗常鋇鞍字剩游峁乖で煞椒ㄥ義希惹暗扒芍式峁茍ゲ庥校戎址椒ǎ捍油芳撲惴�、同源建模法厚勠沷識(shí)別法。從頭逡逑１３逡逑

逡逑進(jìn)行雙酶切的結(jié)果應(yīng)該是Ｈ５２ｂｐ和＾ＯＯｂｐ的兩條條帶。電泳結(jié)巧如圖２－７所示，在逡逑ｌＯＯＯｂｐ和２０００ｂｐ的上方均有條帶，表明與理論結(jié)果相符。逡逑睡＇邋邐＾逡逑Ｋ邐＂１逡逑＾邐？邋ｉ－ｉ逡逑困２－７邋ｍｅｔＫ連接Ｔ毅體的質(zhì)粒進(jìn)行雙髓切后的電泳結(jié)柴逡逑Ｆｉｇ．邋２－７邋Ｄｏｕｂｌｅ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｆｏｒ邋ｐｌａｓｍｉｄ邋ｏｆ邋ＳＡＭ邋ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ邋ｇｅｎｅ邋ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ逡逑ｔｏ邋Ｔ邋ｃａｒｒｉｅｒ逡逑３、將質(zhì)粒進(jìn)行n,序，與Ｇｅｎｂａｎｋ發(fā)表的序列的結(jié)果對(duì)比，顯示兩個(gè)序列完全相符。逡逑—？，逡逑＇Ｓ逡逑２．４．邋３重組巧粗ｐＥＴ－２化（＋）邋－ｍｅｔＫ的構(gòu)建逡逑將ｍｅｔＫ與Ｔ戟體連接的質(zhì)粒和ｐＥＴ－２化（＋邋）質(zhì)粒用Ｎｄｅ邋Ｉ酶和Ｈｉｎｄ邋ｍ酶進(jìn)行逡逑雙酶切：雙酶切后將所需條帶進(jìn)行切膠間收；將切膠回收的ｍｅｔＫ巧酶切后切膠回收逡逑的ｐＥＴ－２２ｂ邋（邋＋邋）載體相連構(gòu)建重組表達(dá)載體ｐＥＴ－２２ｂ邋（邋＋邋）邋－ｍｅＵＣ。將此重組質(zhì)粒進(jìn)行逡逑菌落ＰＣＲ，并將培養(yǎng)的菌液提質(zhì)粒，并將質(zhì)粒用Ｎｄｅｌ酶和Ｈｉｎｄ邋ＩＩＩ酶進(jìn)行雙酶切鑒逡逑．邐定。條帶大小符合預(yù)期的克隆，還需測(cè)序進(jìn)行最終驗(yàn)證。逡逑■邐１、雙酶切結(jié)果顯示，ｐＥＴ－２２ｂ邋（＋）的質(zhì)粒酶切后的電泳條帶在５０００ｂｐ邋Ｗ上。ｍｅｔＫ逡逑與Ｔ載體連接的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后的電泳條帶在ｌＯＯＯｂｐ和２０００ｂｐ邋上，符合結(jié)果，逡逑如圖２－８所示。逡逑４２逡逑
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q814

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本文編號(hào)：2578788