【摘要】：細胞色素c是一類在生物體中廣泛分布的血紅素蛋白,由亞鐵血紅素(heme)和細胞色素c蛋白前體(apocyt c)在細胞色素c成熟系統(tǒng)的作用下共價結(jié)合形成。細胞色素c主要作為電子載體或者氧化還原酶參與細胞的能量傳遞過程,如呼吸作用和光合作用。以Shewanella oneidensis為代表的Shewanella屬細菌的標(biāo)志是呼吸多樣性,這大部分歸功于其含量極其豐富的細胞色素c。本論文在本實驗室前期工作的基礎(chǔ)上,繼續(xù)深入研究S. oneidensis硝酸和亞硝酸呼吸的分子基礎(chǔ),在兩個方面取得了重要的成果：一是確定了為硝酸和亞硝酸還原酶傳遞電子的替代性醌醇氧化酶；二是闡明了亞硝酸還原酶成熟的獨特機制。S. oneidensis采用以位于細胞內(nèi)膜上的細胞色素c CymA為中樞的發(fā)散式電子傳遞網(wǎng)絡(luò),CymA將電子從醌庫傳遞到各個呼吸通路的末端還原酶。然而,CymA的缺失造成多種電子受體(EAs)呼吸能力的減弱而非完全喪失,暗示無氧呼吸通路存在CymA的功能替代物。為了尋找該替代物,本研究采用轉(zhuǎn)座子構(gòu)建隨機突變庫的方法,在ΔcymA的背景下篩選硝酸和亞硝酸呼吸能力進一步減弱的突變株。共獲得87株,轉(zhuǎn)座子插入位置分析顯示,細胞色素bcl復(fù)合體可能是CymA在硝酸和亞硝酸呼吸通路中的替代物。進一步研究發(fā)現(xiàn)泛醌(UQ)和甲基萘醌(MK)都可以為CymA和細胞色素bc1提供電子,但具有一定的偏好性。細胞色素bc1缺失突變株硝酸和亞硝酸呼吸能力比野生型更強,這種改變不是通過提高cymA表達水平或改變醌庫組成來實現(xiàn)的,而可能是由于細胞色素bcl缺失打破了電子分配的平衡,造成了流向CymA的電子流強度的增加。此外,在研究細胞色素bcl的表達調(diào)控時,我們發(fā)現(xiàn)其表達受氧氣而非硝酸和亞硝酸的誘導(dǎo),同時受到全局調(diào)控因子Crp和ArcA的間接調(diào)控。細胞色素c蛋白的亞鐵血紅素結(jié)合位點(heme binding motifs, HBMs)包括兩種：典型和非典型。已有的研究表明典型HBM的成熟由細胞色素c蛋白成熟系統(tǒng)(cytochrome c maturation, Ccm)承擔(dān),而非典型HBM由特異成熟系統(tǒng)完成。S. oneidensis亞硝酸還原酶NrfA擁有4個典型HBMs和1個非典型HBM,但缺乏特異成熟系統(tǒng)。本論文研究揭示在該菌中雖然典型HBM的成熟仍由Ccm系統(tǒng)獨立完成,但NrfA上非典型HBM的成熟也完全依賴于Ccm系統(tǒng),不再需要特異成熟系統(tǒng)。體內(nèi)和體外實驗證明S.oneidensis細胞色素c蛋白這一獨特成熟模式的分子基礎(chǔ)是CcmⅠ。CcmⅠ蛋白由跨膜不可溶部分(CcmⅠ-1)和位于周質(zhì)空間的可溶部分(CcmI-2)組成,在典型HBM成熟過程中重要但非必需,而在NrfA非典型HBM的成熟中完全必需。具體是,CcmⅠ-1功能區(qū)獨立承擔(dān)典型HBM的成熟過程,CcmI-2部分可有可無；NrfA非典型HBM的成熟則需要完整的CcmⅠ,兩部分缺一不可。深入的機制研究表明CcmⅠ-2與NrfA存在直接相互作用,推測CcmⅠ-2在NrfA成熟過程中發(fā)揮分子伴侶功能,負責(zé)向HBM成熟催化中心特異性傳遞NrfA。與之相反,NrfA成熟對CcmⅠ-1的依賴則缺乏特異性,其功能主要是保證典型HBM成熟的高效完成,從而防止NrfA蛋白前體的迅速降解。綜上所述,本研究一是發(fā)現(xiàn)了S. oneidensis擁有CymA的替補呼吸蛋白一細胞色素bc1,解析了其電子傳遞通路的特點和表達調(diào)控機制,完善了S.oneidensis的呼吸網(wǎng)絡(luò)。二是首次發(fā)現(xiàn)了Ccm系統(tǒng)中關(guān)鍵蛋白CcmⅠ在細胞色素c典型和非典型HBMs成熟過程中功能各異,從分子機制上闡明了擁有典型和非典型HBMs的亞硝酸還原酶NrfA的成熟機制。
【圖文】：

氮是蛋白質(zhì)和核酸的義要成分，地巧上的氮Ｗ多種化合價態(tài)共存。作為生逡逑命最重耍的基本元素之一，氮循環(huán)主要是由細菌利用多種多樣的氮代謝途徑來逡逑維持的（圖１．１）。硝酸是環(huán)境中常見的無機氮源，作為地球氮循環(huán)的動為，細逡逑菌進化出了多種硝酸還原途徑。硝酸在細菌生命中發(fā)揮的作用主要有王種：一逡逑是作為氮源維持生長，也就是氮的同化（ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ）；二是作為電子受體，逡逑通過呼吸作用提供能量（ｒｅｓｐｉｒａｔｉｏｎ）；王是去除胞巧過剩的逐原力，Ｗ保持胞逡逑內(nèi)氧化巧原平衡，也就是異化作用（ｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ）（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ邋Ｗ邋ａ／．，２０００）。逡逑氮的同化作用是由ＮＡＳ系統(tǒng)承擔(dān)的，在細胞質(zhì)中將硝酸直接轉(zhuǎn)變成按（Ｓｅａｒｓ邋Ｗ逡逑ａ／．，１９９７）。氮的呼吸和異化作用都與呼吸電子傳遞系統(tǒng)相連，均需要從釀庫獲逡逑取電子。氮的異化作用發(fā)生在細胞內(nèi)膜朝向細胞質(zhì)的部分，Ｎａｒｌ將釀醇氧化，邐．逡逑同時向胞質(zhì)空間釋放兩個質(zhì)子，電予通過ＮａｒＨ的Ｆｅ－Ｓ中傳遞到細胞質(zhì)中的逡逑硝酸還原酶ＮａｒＧ

Ｉ邋ｍ邋ｊＬｎ逡逑Ｌ＾ｆｉ－Ｌ￣￣逡逑ｌｏｆｇａｎｋ邋ｎｉｔｒ0ｇｅｎ｜逡逑圖１．１生物體中氮循環(huán)的過程。ＡＮＡＭＭＯＸ：厭氧氨氧化（ＲｉｃｈａｒｄｓｏｎｅＭ／．，２０００）。逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｎｉｔｒｏｇｅｎ邋ｃｙｃｌｅ．邋ＡＮＡＭＭＯＸ，邋ａｎａｅｒｏｂｉｃ邋ａｍｍｏｎｉｕｍ邋ｏｘｉｄａｔｉｏｎ邋（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ逡逑ｅｔ邋ａｌ．＾邋２０００）．逡逑在多種革蘭氏陰性菌中都有發(fā)現(xiàn)ＮＡＰ的編碼基因，但組成和基因排列各異逡逑（Ｍａｒｉｅｔｏｕｅｆａ／．，２００５）。近幾年確定了邋ＮＡＰ系統(tǒng)至少需要四個組分：ＮａｐＡ、逡逑ＮａｐＢ、ＮａｐＣ和ＮａｐＤ。ＮａｐＡ是含有鉆的硝酸末端還原酶大亞基，，而作為硝酸逡逑末端還原酶小亞基的ＮａｐＢ是一個含兩個ｈｅｍｅ的細胞龜素Ｃ蛋白，負責(zé)將電子逡逑傳遞到ＮａｐＡ，無任何催化活性。ＮａｐＡ和ＮａｐＢ都位于周質(zhì)空間，ＮａｐＣ是含四逡逑個ｈｅｍｅ的ＮａｐＣ／Ｎｉ訂家族的膜蛋白，負責(zé)將電子從^罌餼桑危幔穡麓蕕藉義希危幔穡�。Ｎａ７w奈揮諳赴

本文編號：2576793