【摘要】：海南捕鳥蛛(Haplopelma hainanum[Selenocosmia hainana])主要分布于我國南方地區(qū)的山林地帶,體型較大,能夠捕食鳥類和小型哺乳動物。海南捕鳥蛛毒素-I(HNTX-I)是分離自海南捕鳥蛛毒液的一種神經(jīng)毒素,首先通過電刺激蜘蛛螯肢采集毒液,經(jīng)過冷凍干燥之后得到干粉,然后采用陽離子交換和反相高效液相色譜分離純化得到單一組分HNTX-I。采用膜片鉗技術鑒定了該毒素分子對中電導鈣離子激活鉀通道(intermediate-conductance calcium-activated potassium channel,IK)門控特性的影響。HNTX-I含有33個氨基酸殘基,6個半胱氨酸(Cys)形成3對二硫鍵,一級序列包含兩個相鄰的半胱氨酸,二硫鍵配對方式為I-IV、II-V、III-VI,相對分子質量為3607.1 Da,是海南捕鳥蛛毒液中豐度最高的組分。HNTX-I可以激活IK通道的開放,IK通道在血管上皮細胞的舒張過程中發(fā)揮重要作用,其功能受損可能會導致高血壓等心腦血管疾病的發(fā)生。并且HNTX-I對于大鼠背根神經(jīng)節(jié)上的電壓門控鈉通道、鈣通道和HEK293T細胞上異源表達的電壓門控慢激活延遲整流鉀通道均無明顯效果;對于同源性較高的小電導(small-conductance calcium-activated potassium channel,SK)鈣離子激活鉀通道,飽和劑量的HNTX-I也只能產(chǎn)生微弱的激活效果,而對同一家族的另一成員——大電導(big-conductance calcium-activated potassium channel,BK)鈣離子激活鉀通道,HNTX-I則幾乎沒有作用。同時,通過小鼠膈肌-膈神經(jīng)標本和毒理學的研究,發(fā)現(xiàn)hntx-i不會阻斷神經(jīng)信號的傳導,也沒有明顯的致死性。實驗證明了hntx-i能夠專一性激活ik通道,并沒有產(chǎn)生明顯的毒副作用。敬釗纓毛蛛(chilobrachysguangxiensis[chilobrachysjingzhao])是發(fā)現(xiàn)于我國海南省的一種捕鳥蛛,敬釗纓毛蛛毒素-v(jztx-v)是從該蜘蛛毒液中分離得到的一種廣譜神經(jīng)毒素,能夠抑制大多數(shù)的電壓門控鈉通道和鉀通道,并且已有實驗證明,該毒素能夠和磷脂發(fā)生相互作用。本研究采用固相多肽合成得到jztx-v毒素,并將合成的線性產(chǎn)物氧化復性,再采用羅丹明b(rhodamineb)熒光標記。通過膜片鉗實驗和圓二色譜(circulardichroism,cd)檢測,結果表明帶有熒光標記的jztx-v(r-jztx-v)的電生理活性和二級結構基本和天然毒素分子相同,從而證明熒光標記并未對毒素分子的功能和結構造成顯著影響。我們通過毒素損耗實驗證明了jztx-v能夠和活體細胞膜發(fā)生相互作用,然后使用全內(nèi)反射熒光顯微鏡(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,tirfm)追蹤了帶有熒光標記的單個jztx-v毒素分子在活細胞膜表面運動的軌跡。通過軌跡的分析,我們發(fā)現(xiàn)了單個毒素分子在細胞膜表面主要存在三種運動模式:即無規(guī)則的快速活動、限定區(qū)域的低速運動和相對于膜表面靜止�；谏鲜鰧嶒�,我們建立了一種直觀研究毒素分子和細胞膜相互作用的方法,并初步闡述了毒素分子在細胞膜表面的具體運動情況,為研究毒素分子與膜上離子通道的相互作用奠定了基礎。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了HNTX-I對于IK通道的激活效果,并探討了二者作用的機制,這是首次發(fā)現(xiàn)IK通道的多肽類激活劑。我們利用JZTX-V研究單個毒素分子與活體細胞膜表面的相互作用,是第一次在活細胞體系運用單分子熒光技術研究毒素分子的運動模式。
【圖文】：

圖 1-1 電壓依賴性鉀通道包含 4 個不相連接的亞單位，構成的四聚體通道，其中每個亞單位都含有 1 個帶電荷的電壓感受元件（S4）。電壓依賴性通道蛋白具有 3 種主要功能,一是離子通透功能 ,二是門

圖 1-2 （a）Kir通道結構簡圖。每個亞基包含兩個跨膜螺旋（M1 和M2）、一個含有孔隙-螺旋（P）的孔道形成區(qū)域和由氨基（N）和羧基（C）末端形成的胞質域。 （b）Kir通道在胞外形成四聚體結構。
【學位授予單位】：湖南師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q51

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本文編號：2573411