發(fā)布時(shí)間：2020-01-26 20:39

【摘要】：海南捕鳥蛛(Haplopelma hainanum[Selenocosmia hainana])主要分布于我國(guó)南方地區(qū)的山林地帶,體型較大,能夠捕食鳥類和小型哺乳動(dòng)物。海南捕鳥蛛毒素-I(HNTX-I)是分離自海南捕鳥蛛毒液的一種神經(jīng)毒素,首先通過(guò)電刺激蜘蛛螯肢采集毒液,經(jīng)過(guò)冷凍干燥之后得到干粉,然后采用陽(yáng)離子交換和反相高效液相色譜分離純化得到單一組分HNTX-I。采用膜片鉗技術(shù)鑒定了該毒素分子對(duì)中電導(dǎo)鈣離子激活鉀通道(intermediate-conductance calcium-activated potassium channel,IK)門控特性的影響。HNTX-I含有33個(gè)氨基酸殘基,6個(gè)半胱氨酸(Cys)形成3對(duì)二硫鍵,一級(jí)序列包含兩個(gè)相鄰的半胱氨酸,二硫鍵配對(duì)方式為I-IV、II-V、III-VI,相對(duì)分子質(zhì)量為3607.1 Da,是海南捕鳥蛛毒液中豐度最高的組分。HNTX-I可以激活I(lǐng)K通道的開放,IK通道在血管上皮細(xì)胞的舒張過(guò)程中發(fā)揮重要作用,其功能受損可能會(huì)導(dǎo)致高血壓等心腦血管疾病的發(fā)生。并且HNTX-I對(duì)于大鼠背根神經(jīng)節(jié)上的電壓門控鈉通道、鈣通道和HEK293T細(xì)胞上異源表達(dá)的電壓門控慢激活延遲整流鉀通道均無(wú)明顯效果;對(duì)于同源性較高的小電導(dǎo)(small-conductance calcium-activated potassium channel,SK)鈣離子激活鉀通道,飽和劑量的HNTX-I也只能產(chǎn)生微弱的激活效果,而對(duì)同一家族的另一成員——大電導(dǎo)(big-conductance calcium-activated potassium channel,BK)鈣離子激活鉀通道,HNTX-I則幾乎沒有作用。同時(shí),通過(guò)小鼠膈肌-膈神經(jīng)標(biāo)本和毒理學(xué)的研究,發(fā)現(xiàn)hntx-i不會(huì)阻斷神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo),也沒有明顯的致死性。實(shí)驗(yàn)證明了hntx-i能夠?qū)Ｒ恍约せ頸k通道,并沒有產(chǎn)生明顯的毒副作用。敬釗纓毛蛛(chilobrachysguangxiensis[chilobrachysjingzhao])是發(fā)現(xiàn)于我國(guó)海南省的一種捕鳥蛛,敬釗纓毛蛛毒素-v(jztx-v)是從該蜘蛛毒液中分離得到的一種廣譜神經(jīng)毒素,能夠抑制大多數(shù)的電壓門控鈉通道和鉀通道,并且已有實(shí)驗(yàn)證明,該毒素能夠和磷脂發(fā)生相互作用。本研究采用固相多肽合成得到j(luò)ztx-v毒素,并將合成的線性產(chǎn)物氧化復(fù)性,再采用羅丹明b(rhodamineb)熒光標(biāo)記。通過(guò)膜片鉗實(shí)驗(yàn)和圓二色譜(circulardichroism,cd)檢測(cè),結(jié)果表明帶有熒光標(biāo)記的jztx-v(r-jztx-v)的電生理活性和二級(jí)結(jié)構(gòu)基本和天然毒素分子相同,從而證明熒光標(biāo)記并未對(duì)毒素分子的功能和結(jié)構(gòu)造成顯著影響。我們通過(guò)毒素?fù)p耗實(shí)驗(yàn)證明了jztx-v能夠和活體細(xì)胞膜發(fā)生相互作用,然后使用全內(nèi)反射熒光顯微鏡(totalinternalreflectionfluorescencemicroscopy,tirfm)追蹤了帶有熒光標(biāo)記的單個(gè)jztx-v毒素分子在活細(xì)胞膜表面運(yùn)動(dòng)的軌跡。通過(guò)軌跡的分析,我們發(fā)現(xiàn)了單個(gè)毒素分子在細(xì)胞膜表面主要存在三種運(yùn)動(dòng)模式:即無(wú)規(guī)則的快速活動(dòng)、限定區(qū)域的低速運(yùn)動(dòng)和相對(duì)于膜表面靜止�；谏鲜鰧�(shí)驗(yàn),我們建立了一種直觀研究毒素分子和細(xì)胞膜相互作用的方法,并初步闡述了毒素分子在細(xì)胞膜表面的具體運(yùn)動(dòng)情況,為研究毒素分子與膜上離子通道的相互作用奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)了HNTX-I對(duì)于IK通道的激活效果,并探討了二者作用的機(jī)制,這是首次發(fā)現(xiàn)IK通道的多肽類激活劑。我們利用JZTX-V研究單個(gè)毒素分子與活體細(xì)胞膜表面的相互作用,是第一次在活細(xì)胞體系運(yùn)用單分子熒光技術(shù)研究毒素分子的運(yùn)動(dòng)模式。
【圖文】：

圖 1-1 電壓依賴性鉀通道包含 4 個(gè)不相連接的亞單位，構(gòu)成的四聚體通道，其中每個(gè)亞單位都含有 1 個(gè)帶電荷的電壓感受元件（S4）。電壓依賴性通道蛋白具有 3 種主要功能,一是離子通透功能 ,二是門

圖 1-2 （a）Kir通道結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖。每個(gè)亞基包含兩個(gè)跨膜螺旋（M1 和M2）、一個(gè)含有孔隙-螺旋（P）的孔道形成區(qū)域和由氨基（N）和羧基（C）末端形成的胞質(zhì)域。 （b）Kir通道在胞外形成四聚體結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：湖南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q51

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本文編號(hào)：2573411