本文關(guān)鍵詞：PMAP-36的分子改良及其作用機(jī)理的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：PMAP-36是來(lái)源于豬骨髓含36個(gè)氨基酸的陽(yáng)離子抗菌肽。本研究以PMAP-36為模板,通過(guò)優(yōu)化相關(guān)結(jié)構(gòu)參數(shù),如兩親性、結(jié)構(gòu)傾向性等對(duì)其進(jìn)行改良,在此基礎(chǔ)上測(cè)定了改良肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R的抗菌活性和作用機(jī)理;篩選出具有特異性抗綠膿桿菌肽T9W,評(píng)估了T9W抗綠膿桿菌效果;基于T9W序列特征,全新設(shè)計(jì)一系列含有七肽重復(fù)序列的抗菌肽,比較了這些肽在抗綠膿桿菌和作用機(jī)制方面的差異。主要研究結(jié)果如下:(1)非完美兩親性抗菌肽的設(shè)計(jì)。兩親性是影響抗菌肽活性的重要參數(shù)之一。完美兩親性結(jié)構(gòu)通�？梢蕴岣呖咕牡幕钚�,但同時(shí)也會(huì)引起細(xì)胞毒性的增加。通過(guò)分析PMAP-36序列及氨基酸組成,采用序列截短和氨基酸替換方法,設(shè)計(jì)一系列非完美兩親性α-螺旋抗菌肽。首先,截取PMAP-36 N端16個(gè)氨基酸序列,命名為RI16。與PMAP-36相比,RI16具有完美的兩親性結(jié)構(gòu)。根據(jù)α-螺旋蛋白折疊原則,利用色氨酸(Trp)替換兩親性結(jié)構(gòu)極性面中的成對(duì)的賴氨酸(Lys)設(shè)計(jì)了一系列非完美兩親性抗菌肽。結(jié)果表明,具有氫鍵連接的Trp改良肽PRW4具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性,其最小抑菌濃度(MIC)在4-8μM之間,同時(shí)不具有細(xì)胞毒性。PRW4可透化細(xì)菌細(xì)胞外膜和內(nèi)膜,引起膜電勢(shì)發(fā)生改變,破壞細(xì)胞膜完整性。掃描電鏡和透射電鏡觀測(cè)結(jié)果表明,PRW4引起細(xì)胞膜形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞內(nèi)容物釋放,表明PRW4通過(guò)破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抗菌作用。這些結(jié)果表明,適度破壞抗菌肽的兩親性在提高抗菌活性的同時(shí),能夠降低細(xì)胞毒性。(2)具有不同螺旋傾向性抗菌肽的設(shè)計(jì)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證和研究非完美兩親性抗菌肽的優(yōu)化或設(shè)計(jì)方法,以PRW4為模板,分別利用具有不同螺旋傾向性的氨基酸半胱氨酸(Cys)、天門冬氨酸(Asp)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和D-色氨酸(D-Trp)替換PRW4中的Trp。同時(shí),為了研究精氨酸(Arg)的重要作用,將PRW4中的Lys全部替換成Arg。結(jié)果表明,與PRW4相比,D-Trp取代的抗菌肽PRW4-d比Cys(C4)、Asp(D4)、Ile(I4)和Pro(P4)取代的抗菌肽活性高。而且,Arg取代抗菌肽PRW4-R的抗菌活性和細(xì)胞選擇性進(jìn)一步提高。優(yōu)化的肽序列PRW4-d和PRW4-R通過(guò)引起細(xì)胞膜電勢(shì)能損失,通透性增加,完整性破壞發(fā)揮抗菌作用。這些結(jié)果對(duì)設(shè)計(jì)或優(yōu)化短鏈抗菌肽具有一定的借鑒意義。(3)疏水面完整性對(duì)抗菌肽活性的影響。在兩親性結(jié)構(gòu)中,疏水面的完整性對(duì)抗菌肽的活性具有重要影響。RI16疏水面的中心位置是一個(gè)中性氨基酸蘇氨酸(Thr),為了研究疏水面完整性對(duì)抗菌肽活性的影響,以RI16為模板,分別利用帶正電荷氨基酸Lys(T9K)、疏水性氨基酸Ile(T9I),以及芳香族氨基酸Trp(T9W)和苯丙氨酸(Phe)(T9F)替換RI16序列中的Thr。結(jié)果表明,疏水面的完整性與抗菌肽的抗菌活性之間沒(méi)有顯著的相關(guān)關(guān)系。疏水面中心位置的Trp是抗菌肽T9W發(fā)揮抗綠膿桿菌活性的關(guān)鍵。T9W具有較強(qiáng)的抗綠膿桿菌活性,包括臨床和耐藥菌株,其MIC為1-2μM,致死濃度(LC)為1-4μM,表明T9W通過(guò)殺菌機(jī)制發(fā)揮抗綠膿桿菌活性。殺菌動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明,T9W在30 min(1×LC)或5 min(4×LC)內(nèi)可快速殺死綠膿桿菌,包括耐藥菌株。而且,T9W與抗生素環(huán)丙沙星和慶大霉素具有協(xié)同效應(yīng)。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明,T9W對(duì)紅細(xì)胞和巨噬細(xì)胞均沒(méi)有毒性。細(xì)胞選擇性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明,T9W能夠有效地清除細(xì)胞外的綠膿桿菌,而對(duì)細(xì)胞本身沒(méi)有毒性。此外,T9W還具有較強(qiáng)的鹽離子穩(wěn)定性和抗生物被膜(biofilm)活性。T9W主要是通過(guò)與綠膿桿菌細(xì)胞外膜LPS結(jié)合,聚集在細(xì)胞表面,破壞質(zhì)膜完整性,引起細(xì)胞內(nèi)容物泄漏,從而達(dá)到殺菌目的。這些結(jié)果表明T9W具有開發(fā)成抗綠膿桿菌藥物的潛力。(4)七肽重復(fù)序列抗菌肽的全新設(shè)計(jì)。根據(jù)T9W的序列特征,利用亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)、Trp、Phe和Arg,全新設(shè)計(jì)含有七肽重復(fù)序列模型的抗菌肽分子,其序列模型為(abcdefg)n-(W)n-(gfedcba)n(a和d分別為L(zhǎng)eu、Ala、Trp和Phe,b、c、e、f和g為Arg,W為Trp,n為重復(fù)單位)。結(jié)果表明,a和d位置為L(zhǎng)eu的肽序列具有更強(qiáng)的抗菌活性。七肽重復(fù)序列的延長(zhǎng)誘導(dǎo)肽鏈形成coiled-coil結(jié)構(gòu),表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌活性,而增加七肽重復(fù)序列之間的Trp影響肽鏈螺旋結(jié)構(gòu)的形成和細(xì)胞選擇性。優(yōu)化的肽序列能夠有效地清除綠膿桿菌biofilm,中和內(nèi)毒素,以及具有較強(qiáng)的鹽離子穩(wěn)定性。此外,這些肽序列能夠引起細(xì)胞膜通透性增加,質(zhì)膜完整性破壞,從而發(fā)揮抗菌活性。本研究以豬源抗菌肽PMAP-36為模板,通過(guò)破壞抗菌肽兩親性的思路設(shè)計(jì)了一系列的α-螺旋抗菌肽,篩選出的抗菌肽PRW4、PRW4-d和PRW4-R具有廣譜抗菌活性;優(yōu)化的抗菌肽T9W具有特異性抗綠膿桿菌活性;設(shè)計(jì)的含有七肽重復(fù)序列的抗菌肽也具有較強(qiáng)的抗綠膿桿菌活性。初步探明篩選出的改良肽是通過(guò)與細(xì)胞膜相互作用發(fā)揮抗菌功能的。這些結(jié)果為研制新型抗菌藥物提供了優(yōu)良的候選抗菌肽,為有效替代或減少抗生素作為飼料添加劑的使用、提高畜產(chǎn)品安全性等方面具有重要借鑒和參考意義。
【關(guān)鍵詞】：PMAP-36 機(jī)制 改造 兩親性 綠膿桿菌
【學(xué)位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q51
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 引言15-29
• 1.1 抗菌肽研究概述15-19
• 1.1.1 抗菌肽的分類15-17
• 1.1.2 抗菌肽的物理化學(xué)和結(jié)構(gòu)參數(shù)17-19
• 1.2 抗菌肽的作用機(jī)制19-22
• 1.3 抗菌肽的生物學(xué)功能22-25
• 1.3.1 抗細(xì)菌22-23
• 1.3.2 抗真菌23-24
• 1.3.3 抗癌24
• 1.3.4 抗蟲24
• 1.3.5 抗病毒24-25
• 1.3.6 免疫調(diào)節(jié)25
• 1.4 豬源抗菌肽PMAP-36的研究進(jìn)展25-27
• 1.4.1 PMAP-36的來(lái)源與結(jié)構(gòu)25-26
• 1.4.2 PMAP-36的抗菌性和溶血性26
• 1.4.3 PMAP-36的作用機(jī)制26-27
• 1.5 本研究的目的意義和主要內(nèi)容27-29
• 2 材料與方法29-39
• 2.1 試驗(yàn)材料29-30
• 2.1.1 抗菌肽合成29
• 2.1.2 菌株29
• 2.1.3 試劑29-30
• 2.1.4 儀器30
• 2.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定30-31
• 2.3 抗菌肽的生物學(xué)活性測(cè)定31-35
• 2.3.1 抗菌活性的測(cè)定31-32
• 2.3.2 細(xì)胞毒性的測(cè)定32-34
• 2.3.3 鹽離子穩(wěn)定性的測(cè)定34
• 2.3.4 抗生物被膜（BIOFILM）活性的測(cè)定34-35
• 2.3.5 內(nèi)毒素中和活性的測(cè)定35
• 2.4 抗菌肽的抑菌機(jī)理35-38
• 2.4.1 外膜通透性的測(cè)定35-36
• 2.4.2 內(nèi)膜通透性的測(cè)定36
• 2.4.3 細(xì)胞電勢(shì)能的測(cè)定36-37
• 2.4.4 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定37
• 2.4.5 細(xì)胞膜形態(tài)的觀測(cè)37-38
• 2.5 數(shù)據(jù)分析38-39
• 3 結(jié)果與分析39-88
• 3.1 抗菌肽分子改良與設(shè)計(jì)39-45
• 3.1.1 非完美兩親性抗菌肽的設(shè)計(jì)39-41
• 3.1.2 低Α-螺旋傾向性抗菌肽的設(shè)計(jì)41-42
• 3.1.3 抗菌肽RI16的分子改造42-44
• 3.1.4 七肽重復(fù)序列抗菌肽的全新設(shè)計(jì)44-45
• 3.2 抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析45-50
• 3.2.1 非完美兩親性抗菌肽的設(shè)計(jì)45-46
• 3.2.2 低Α-螺旋傾向性抗菌肽的設(shè)計(jì)46-48
• 3.2.3 抗菌肽RI16的分子改造48-49
• 3.2.4 七肽重復(fù)序列抗菌肽的全新設(shè)計(jì)49-50
• 3.3 抗菌肽的生物學(xué)活性50-64
• 3.3.1 抗菌活性50-55
• 3.3.2 抗菌肽的細(xì)胞毒性與選擇性55-57
• 3.3.3 鹽離子穩(wěn)定性57-61
• 3.3.4 抗BIOFILM活性61-63
• 3.3.5 內(nèi)毒素中和活性63-64
• 3.4 抗菌肽的作用機(jī)理64-88
• 3.4.1 外膜通透性64-67
• 3.4.2 內(nèi)膜通透性67-69
• 3.4.3 質(zhì)膜電勢(shì)能變化69-74
• 3.4.4 細(xì)胞膜完整性的測(cè)定74-77
• 3.4.5 細(xì)胞膜完整性的觀測(cè)77-88
• 4 討論88-102
• 4.1 抗菌肽分子改良與設(shè)計(jì)88-91
• 4.1.1 非完美兩親性抗菌肽的設(shè)計(jì)88-89
• 4.1.2 低Α-螺旋傾向性抗菌肽的設(shè)計(jì)89-90
• 4.1.3 抗菌肽RI-16的分子改造90
• 4.1.4 七肽重復(fù)序列抗菌肽的全新設(shè)計(jì)90-91
• 4.2 抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)91-94
• 4.2.1 非完美兩親性抗菌肽的設(shè)計(jì)91-92
• 4.2.2 低Α-螺旋傾向性抗菌肽的設(shè)計(jì)92-93
• 4.2.3 抗菌肽RI-16的分子改造93
• 4.2.4 七肽重復(fù)序列抗菌肽的全新設(shè)計(jì)93-94
• 4.3 抗菌肽的生物學(xué)活性94-100
• 4.3.1 抗菌活性94-97
• 4.3.2 抗菌肽的細(xì)胞毒性和選擇性97-98
• 4.3.3 鹽離子穩(wěn)定性98
• 4.3.4 抗BIOFILM活性98-99
• 4.3.5 內(nèi)毒素中和活性99-100
• 4.4 抗菌肽的作用機(jī)理100-102
• 5 結(jié)論102-103
• 致謝103-104
• 參考文獻(xiàn)104-121
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文121-122

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