【摘要】：藍藻廣泛分布在地球上幾乎所有的陸地和水生棲息地,在長期進化過程中藍藻形成了一套靈敏且高效的環(huán)境信號感知及應答調控系統(tǒng),以應對長期進化過程中不斷變化的不利環(huán)境條件。眾所周知,二元信號轉導系統(tǒng)(TCS)是原核生物中主要信號轉導系統(tǒng),TCS在藍藻感知環(huán)境變化并將其轉化為細胞內信號的過程中發(fā)揮著重要作用,TCS感知環(huán)境信號并進一步調控細胞內相應蛋白的差異表達,最終實現(xiàn)細胞對環(huán)境的適應。典型的TCS通常由負責信號感知的組氨酸激酶(Hik)和負責基因調控的響應調節(jié)因子(Rre)構成。自然生長條件下的藍藻經常需要面對各類環(huán)境脅迫條件,如高光脅迫、氧化脅迫、低溫脅迫、鹽脅迫、滲透壓脅迫等。組氨酸激酶Hik33在藍藻響應各種環(huán)境脅迫條件的過程中發(fā)揮著極其重要的作用。Hik33在藍藻中高度保守且在其它原核生物中同源性很低,這預示著Hik33在協(xié)調光合作用和應激反應過程中起著不可替代的作用。雖然大量研究已表明Hik33在藍藻應急調控中發(fā)揮著重要的作用,但Hik33如何感受環(huán)境信號并進一步調控藍藻細胞做出相應應答反應在很大程度上仍然未知。系統(tǒng)性研究Hik33依賴的差異基因的表達可以為研究Hik33在應急反應中的作用提供重要信息。但目前已知的信息僅停留在轉錄水平,且大多數(shù)研究僅局限于單一脅迫條件。由于轉錄水平往往與蛋白質水平缺乏較好的一致性,且Hik33在多種脅迫條件下均發(fā)揮著重要的調控作用,因此單一的轉錄水平信息遠遠無法滿足Hik33作為全局性脅迫調控因子發(fā)揮作用的機理分析。本論文研究中,我們以大規(guī)模定量蛋白質組學的方法在細胞不同的營養(yǎng)方式和不同碳源可獲得性條件下研究了集胞藻Hik33缺失突變體中不同功能蛋白的差異表達變化情況。1.Hik33調控通用型應激響應(CommonStress-ResponsiveCSR)蛋白的差異表達實現(xiàn)對集胞藻6803環(huán)境壓力應答的調控。通過使用定量蛋白質組學方法和生物信息學分析手段,我們發(fā)現(xiàn)Hik33的敲除顯著影響了集胞藻6803中208個蛋白下調和369個蛋白質上調。在這些變化顯著的蛋白中還包含了 60個通用型應激響應(Common Stress-Responsive CSR)蛋白。在下調的蛋白中,最顯著的功能富集分類是光合作用,特別是光系統(tǒng)Ⅰ和藻膽體蛋白,此類功能蛋白可提供細胞生長所需的碳源和能量,因此對集胞藻的生長和增殖是至關重要的。這些功能蛋白的下調表明,Hik33突變體或應激條件下的野生型細胞需要分別通過犧牲生長或增值水平來應對由Hik33敲除或應激引起的細胞內部的不良反應。相比之下,許多熱休克蛋白、伴侶蛋白、蛋白酶蛋白和參與細胞內氧化還原狀態(tài)調節(jié)的蛋白都因Hik33的敲除或脅迫應激而上調。蛋白質變性發(fā)生在幾乎所有脅迫應激條件下,并導致變性蛋白質在胞質溶膠中的積累,這些變性蛋白的積累會進一步引發(fā)脅迫反應。熱休克蛋白、伴侶蛋白和蛋白酶蛋白,如HspA、HtpG、GroEL1、DnaJ和ClpC的上調對于修復這種損傷是必要的,對于細胞存活也是必須的。此外,脅迫條件和Hik33的缺失也可能誘導細胞內氧化還原狀態(tài)的改變和ROS的產生。因此,參與氧化還原調節(jié)和ROS清除的蛋白,包括MrgA(Slr1894)、過氧化物酶 S110755 和 Slr0242、Gpx1 (Slr1711)和 Gpx2 (Slr1922)、SodB、KatF (S111987)和Tpx (S07575)也同樣上調。最后,在脅迫條件或Hik33突變體中,光系統(tǒng)Ⅱ的損傷也將導致應激反應,這需要更多的蛋白質,如FtsH和OCP進行保護和修復。綜上所述,上調蛋白質的功能雖然各異,但對于保護藍藻免受脅迫條件或Hik33敲除引起的損傷都是至關重要的。因此,我們認為,對于增殖和生存的協(xié)調可能是藍藻在環(huán)境壓力條件下經長期進化而演變出的生存策略,而Hik33則可能是這一生存策略的具體實施和關鍵調控因子。這也更加凸顯了 Hik33作為集胞藻6803中全局性調控因子的重要地位。2. △Hik33通過上調OPP途徑獲得更高效的葡萄糖利用率生長表型研究發(fā)現(xiàn),當培養(yǎng)基中額外添加葡萄糖時可顯著恢復Hik33突變體生長。為了進一步探究Hik33缺失誘導的應激反應是否是由于碳素缺乏導致,以及光抑制條件下藍藻細胞如何利用有機碳源。我們在培養(yǎng)過程中額外補充葡萄糖(5% ),定量比較該培養(yǎng)條件下Hik33突變體與野生型細胞蛋白質組水平的差異,進一步探究了 Hik33突變體對有機碳源的同化策略。根據(jù)藍細菌光合活性的水平,葡萄糖可以通過不同的途徑被分解代謝。當光合作用被抑制時,例如在黑暗中或在PET抑制劑的存在下,如DCMU,外源葡萄糖主要通過可產生NADPH的戊糖磷酸途徑(Oxidative Pentose Phosphate,OPP)途徑分解代謝。當光合作用被激活時,如在光照條件下或不存在PET抑制劑的情況,外源葡萄糖主要通過糖酵解的上游部分和卡爾文循環(huán)(Calvincycle)途徑代謝。然而,葡萄糖在受到部分光抑制的野生型細胞或Hik33敲除突變體細胞中是如何被降解利用的,目前為止對于該領域的研究還并不清楚。為了揭示Hik33突變體快速光合混合營養(yǎng)生長的蛋白質組學基礎,我們比較了 Hik33突變體和野生型細胞之間在正常和額外添加葡萄糖培養(yǎng)條件下,與碳代謝相關蛋白的差異表達情況。通過蛋白質組學數(shù)據(jù)的分析,我們發(fā)現(xiàn),所有涉及NADPH產生的OPP通路中的關鍵酶蛋白,如Zwf、OpcA、Gnd和Pgl等,與野生型細胞相比該類蛋白表達量水平都由在正常培養(yǎng)條件下的顯著或微量下調變成了在外加葡萄糖培養(yǎng)條件下的顯著或微量上調,這也預示著Hik33突變體可能獲得了額外的利用葡萄糖的能力。事實上,在光激活的異養(yǎng)生長(Light-Activated Heterotrophic Growth,LAHG)條件下培養(yǎng)時,此時葡萄糖是唯一的碳源和能源,而且葡萄糖只能通過OPP途徑降解,在該條件下Hik33突變體生長速率較野生型細胞有一定幅度的上升。這一結果進一步表明,Hik33突變體通過上調OPP途徑獲得了較高的葡萄糖利用效率。值得注意的是,在LAHG條件下,突變體的葉綠素含量仍然低于野生型細胞,這表明在LAHG條件下Hik33缺失誘導的應激反應并沒有被消除�？傊�,以上結果均表明,Hik33敲除突變體可以更好的利用葡萄糖,而且最有可能通過上調OPP途徑的關鍵酶蛋白來實現(xiàn)這一目的,但與此同時,由于Hik33本身缺失引發(fā)的細胞內應激反應并沒有消除�；诘鞍踪|組學和表型實驗結果,我們提出了一個模型來解釋在光合混合營養(yǎng)生長條件下葡萄糖在Hik33缺失突變體中分解代謝的途徑。在野生型細胞中,正如前人使用13C標記的葡萄糖進行的代謝通量分析實驗結果所示,經過OPP途徑代謝的碳流量幾乎可以忽略不計。然而,在Hik33突變體細胞中,OPP變成了葡萄糖降解利用的主要途徑,或者至少部分提供了用于C02同化的NADPH和RuBP。3. △Hik33通過調控PetE和PetJ的差異性表達實現(xiàn)高濃度C02培養(yǎng)條件下快速生長在培養(yǎng)Hik33缺失突變體時發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)液中額外補充5%濃度的CO2氣體,可顯著提高Hik33突變體的生長。為了探究hik33缺失突變體在光合受損及NADPH供應量不足的情況下CO2的固定策略,我們在培養(yǎng)過程中額外補充過量CO2 (5%),定量比較該培養(yǎng)條件下Hik33突變體與野生型細胞蛋白質組水平的差異,以期揭示藍藻在光系統(tǒng)受損情況下(如Hik33突變體)NADPH供應及C02同化策略。與在正常培養(yǎng)條件下Hik33突變體和野生型細胞的蛋白質組學數(shù)據(jù)相比較,高濃度CO2培養(yǎng)條件并沒有大范圍改變突變體和野生型細胞中的蛋白表達水平,但同時也存在個別變化顯著的蛋白。如CupB、NdhD4、PetE和PetJ。雖然CupB和NdhD4表達水平的變化預示著C02可獲得性的變化,但這些變化并不能促進Hik33突變體的光自養(yǎng)生長。在藍藻中,光合電子傳遞鏈(photosynthetic electron transport,PET)和呼吸電子傳遞鏈(respiratory electron transport,RET)均位于類囊體膜上,兩個電子傳輸鏈彼此相互交織并且共享幾個共同組分,例如,質體醌,細胞色素b6/f符合體和可溶性電子載體等。因此,不產生NADPH的RET可能與PET在內囊體膜電子流分配上存在競爭關系。PetE和PetJ是藍藻細胞中僅有的兩個可以將電子從細胞色素b6/f復合體傳遞到光系統(tǒng)Ⅰ和/或呼吸電子傳遞鏈末端氧化酶的可溶性電子載體。正常培養(yǎng)條件下,與野生型細胞相比,這兩個蛋白在Hik33突變體中的表達量并沒有太大變化,說明在普通培養(yǎng)條件下Hik33缺失突變體中,PetE和PetJ并沒有被誘導或抑制表達。然而,在高濃度CO2培養(yǎng)條件下,與野生型集胞藻細胞相比Hik33缺失突變體中PetE蛋白的表達量出現(xiàn)了顯著上調,而PetJ的表達量卻顯著下調。PetE的上調和PetJ的下調可能揭示了 Hik33缺失突變體在高濃度CO2培養(yǎng)條件下實現(xiàn)快速生長的策略。在此條件下,CO2的可獲得性已經不再是突變體生長的主要限制因素,但突變體的快速生長仍需要光合作用提供大量的NADPH用于CO2的固定。然而,突變體中主要光合機元件,如PsbO, PBS和PSI的下調并沒有因高濃度CO2的培養(yǎng)條件而顯著改變,NADPH的產生依賴于光系統(tǒng)的光電子傳遞,因此這仍構成了突變體實現(xiàn)高速生長的瓶頸�？朔@個瓶頸的一個潛在的方法便是通過控制類囊體膜上電子傳遞的流向,使其盡可能少的流向呼吸電子傳遞鏈而最大化流向光合電子傳遞鏈,并用于NADPH生產。由于光合電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈都定位在類囊體膜上,且共享相同的兩個可溶性電子傳遞載體PetE和PetJ。在高濃度C02培養(yǎng)條件下,與野生型藻細胞相比,Hik33突變體中顯著上調的PetE和顯著下調的PetJ可能致使類囊體膜上的電子大量流向光合電子傳遞鏈的PSI而非呼吸電子傳遞鏈的末端氧化酶,這便可以為光合電子傳遞鏈提供充足的電子,進而產生充足的NADPH供應藻細胞固定CO2使用。
【圖文】：

大量研究表明植物的葉綠極有可能是由藍藻的類囊體的片層結構演化而來逡逑（２０）。不過像藍藻這樣光合作用和呼吸作用同時存在于相同的膜系統(tǒng)上的物種是逡逑不多見的。藍藻類囊體膜上的主要光合復合物結構示意圖如圖１－２所示。逡逑１６逡逑

光合作用僅發(fā)生在類囊體膜上，而呼吸作用既存在于類囊體膜上，，又存在于細胞逡逑質膜上（６，９－１１）。逡逑圖１－１：藍藻的細胞的結構圖（６）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１：邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｖｅｒｖｉｅｗ邋ｏｆ邋ａ邋ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｃｅｌｌ．逡逑１．１．２藍藻的光合作用逡逑藍藻的光合作用主要發(fā)生在類囊體膜，同時類囊體膜也是呼吸作用及其它生逡逑理代謝的重要場所（８）。與高等植物類似，藍藻可進行產氧光合作用（１２）。存在于逡逑類囊體膜上的光合蛋白復合物有藻膽體（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅ）邋（１３）、光系統(tǒng)ＩＩ復合物逡逑（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩ）（１４，１５）、細胞色素邋ｂ６ｆ邋復合體（１６）、光系統(tǒng)邋Ｉ邋復合物（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ逡逑Ｉ）邋（１７）和ＡＴＰ合酶等（１８，１９）。光驅動的電子傳遞鏈貫穿于整個類囊體膜，與植物逡逑的光合作用的電子傳遞鏈非常相似，只是在蛋白復合物的組成上有些差別。實際逡逑上，大量研究表明植物的葉綠極有可能是由藍藻的類囊體的片層結構演化而來逡逑（２０）。不過像藍藻這樣光合作用和呼吸作用同時存在于相同的膜系統(tǒng)上的物種是逡逑不多見的。藍藻類囊體膜上的主要光合復合物結構示意圖如圖１－２所示。逡逑１６逡逑
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q946


本文編號：2550546