【摘要】：藍(lán)藻廣泛分布在地球上幾乎所有的陸地和水生棲息地,在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中藍(lán)藻形成了一套靈敏且高效的環(huán)境信號(hào)感知及應(yīng)答調(diào)控系統(tǒng),以應(yīng)對(duì)長(zhǎng)期進(jìn)化過程中不斷變化的不利環(huán)境條件。眾所周知,二元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCS)是原核生物中主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),TCS在藍(lán)藻感知環(huán)境變化并將其轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的過程中發(fā)揮著重要作用,TCS感知環(huán)境信號(hào)并進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的差異表達(dá),最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞對(duì)環(huán)境的適應(yīng)。典型的TCS通常由負(fù)責(zé)信號(hào)感知的組氨酸激酶(Hik)和負(fù)責(zé)基因調(diào)控的響應(yīng)調(diào)節(jié)因子(Rre)構(gòu)成。自然生長(zhǎng)條件下的藍(lán)藻經(jīng)常需要面對(duì)各類環(huán)境脅迫條件,如高光脅迫、氧化脅迫、低溫脅迫、鹽脅迫、滲透壓脅迫等。組氨酸激酶Hik33在藍(lán)藻響應(yīng)各種環(huán)境脅迫條件的過程中發(fā)揮著極其重要的作用。Hik33在藍(lán)藻中高度保守且在其它原核生物中同源性很低,這預(yù)示著Hik33在協(xié)調(diào)光合作用和應(yīng)激反應(yīng)過程中起著不可替代的作用。雖然大量研究已表明Hik33在藍(lán)藻應(yīng)急調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用,但Hik33如何感受環(huán)境信號(hào)并進(jìn)一步調(diào)控藍(lán)藻細(xì)胞做出相應(yīng)應(yīng)答反應(yīng)在很大程度上仍然未知。系統(tǒng)性研究Hik33依賴的差異基因的表達(dá)可以為研究Hik33在應(yīng)急反應(yīng)中的作用提供重要信息。但目前已知的信息僅停留在轉(zhuǎn)錄水平,且大多數(shù)研究?jī)H局限于單一脅迫條件。由于轉(zhuǎn)錄水平往往與蛋白質(zhì)水平缺乏較好的一致性,且Hik33在多種脅迫條件下均發(fā)揮著重要的調(diào)控作用,因此單一的轉(zhuǎn)錄水平信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)無法滿足Hik33作為全局性脅迫調(diào)控因子發(fā)揮作用的機(jī)理分析。本論文研究中,我們以大規(guī)模定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法在細(xì)胞不同的營養(yǎng)方式和不同碳源可獲得性條件下研究了集胞藻Hik33缺失突變體中不同功能蛋白的差異表達(dá)變化情況。1.Hik33調(diào)控通用型應(yīng)激響應(yīng)(CommonStress-ResponsiveCSR)蛋白的差異表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)集胞藻6803環(huán)境壓力應(yīng)答的調(diào)控。通過使用定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法和生物信息學(xué)分析手段,我們發(fā)現(xiàn)Hik33的敲除顯著影響了集胞藻6803中208個(gè)蛋白下調(diào)和369個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)。在這些變化顯著的蛋白中還包含了 60個(gè)通用型應(yīng)激響應(yīng)(Common Stress-Responsive CSR)蛋白。在下調(diào)的蛋白中,最顯著的功能富集分類是光合作用,特別是光系統(tǒng)Ⅰ和藻膽體蛋白,此類功能蛋白可提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的碳源和能量,因此對(duì)集胞藻的生長(zhǎng)和增殖是至關(guān)重要的。這些功能蛋白的下調(diào)表明,Hik33突變體或應(yīng)激條件下的野生型細(xì)胞需要分別通過犧牲生長(zhǎng)或增值水平來應(yīng)對(duì)由Hik33敲除或應(yīng)激引起的細(xì)胞內(nèi)部的不良反應(yīng)。相比之下,許多熱休克蛋白、伴侶蛋白、蛋白酶蛋白和參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)的蛋白都因Hik33的敲除或脅迫應(yīng)激而上調(diào)。蛋白質(zhì)變性發(fā)生在幾乎所有脅迫應(yīng)激條件下,并導(dǎo)致變性蛋白質(zhì)在胞質(zhì)溶膠中的積累,這些變性蛋白的積累會(huì)進(jìn)一步引發(fā)脅迫反應(yīng)。熱休克蛋白、伴侶蛋白和蛋白酶蛋白,如HspA、HtpG、GroEL1、DnaJ和ClpC的上調(diào)對(duì)于修復(fù)這種損傷是必要的,對(duì)于細(xì)胞存活也是必須的。此外,脅迫條件和Hik33的缺失也可能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的改變和ROS的產(chǎn)生。因此,參與氧化還原調(diào)節(jié)和ROS清除的蛋白,包括MrgA(Slr1894)、過氧化物酶 S110755 和 Slr0242、Gpx1 (Slr1711)和 Gpx2 (Slr1922)、SodB、KatF (S111987)和Tpx (S07575)也同樣上調(diào)。最后,在脅迫條件或Hik33突變體中,光系統(tǒng)Ⅱ的損傷也將導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng),這需要更多的蛋白質(zhì),如FtsH和OCP進(jìn)行保護(hù)和修復(fù)。綜上所述,上調(diào)蛋白質(zhì)的功能雖然各異,但對(duì)于保護(hù)藍(lán)藻免受脅迫條件或Hik33敲除引起的損傷都是至關(guān)重要的。因此,我們認(rèn)為,對(duì)于增殖和生存的協(xié)調(diào)可能是藍(lán)藻在環(huán)境壓力條件下經(jīng)長(zhǎng)期進(jìn)化而演變出的生存策略,而Hik33則可能是這一生存策略的具體實(shí)施和關(guān)鍵調(diào)控因子。這也更加凸顯了 Hik33作為集胞藻6803中全局性調(diào)控因子的重要地位。2. △Hik33通過上調(diào)OPP途徑獲得更高效的葡萄糖利用率生長(zhǎng)表型研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)培養(yǎng)基中額外添加葡萄糖時(shí)可顯著恢復(fù)Hik33突變體生長(zhǎng)。為了進(jìn)一步探究Hik33缺失誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)是否是由于碳素缺乏導(dǎo)致,以及光抑制條件下藍(lán)藻細(xì)胞如何利用有機(jī)碳源。我們?cè)谂囵B(yǎng)過程中額外補(bǔ)充葡萄糖(5% ),定量比較該培養(yǎng)條件下Hik33突變體與野生型細(xì)胞蛋白質(zhì)組水平的差異,進(jìn)一步探究了 Hik33突變體對(duì)有機(jī)碳源的同化策略。根據(jù)藍(lán)細(xì)菌光合活性的水平,葡萄糖可以通過不同的途徑被分解代謝。當(dāng)光合作用被抑制時(shí),例如在黑暗中或在PET抑制劑的存在下,如DCMU,外源葡萄糖主要通過可產(chǎn)生NADPH的戊糖磷酸途徑(Oxidative Pentose Phosphate,OPP)途徑分解代謝。當(dāng)光合作用被激活時(shí),如在光照條件下或不存在PET抑制劑的情況,外源葡萄糖主要通過糖酵解的上游部分和卡爾文循環(huán)(Calvincycle)途徑代謝。然而,葡萄糖在受到部分光抑制的野生型細(xì)胞或Hik33敲除突變體細(xì)胞中是如何被降解利用的,目前為止對(duì)于該領(lǐng)域的研究還并不清楚。為了揭示Hik33突變體快速光合混合營養(yǎng)生長(zhǎng)的蛋白質(zhì)組學(xué)基礎(chǔ),我們比較了 Hik33突變體和野生型細(xì)胞之間在正常和額外添加葡萄糖培養(yǎng)條件下,與碳代謝相關(guān)蛋白的差異表達(dá)情況。通過蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的分析,我們發(fā)現(xiàn),所有涉及NADPH產(chǎn)生的OPP通路中的關(guān)鍵酶蛋白,如Zwf、OpcA、Gnd和Pgl等,與野生型細(xì)胞相比該類蛋白表達(dá)量水平都由在正常培養(yǎng)條件下的顯著或微量下調(diào)變成了在外加葡萄糖培養(yǎng)條件下的顯著或微量上調(diào),這也預(yù)示著Hik33突變體可能獲得了額外的利用葡萄糖的能力。事實(shí)上,在光激活的異養(yǎng)生長(zhǎng)(Light-Activated Heterotrophic Growth,LAHG)條件下培養(yǎng)時(shí),此時(shí)葡萄糖是唯一的碳源和能源,而且葡萄糖只能通過OPP途徑降解,在該條件下Hik33突變體生長(zhǎng)速率較野生型細(xì)胞有一定幅度的上升。這一結(jié)果進(jìn)一步表明,Hik33突變體通過上調(diào)OPP途徑獲得了較高的葡萄糖利用效率。值得注意的是,在LAHG條件下,突變體的葉綠素含量仍然低于野生型細(xì)胞,這表明在LAHG條件下Hik33缺失誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)并沒有被消除�？傊�,以上結(jié)果均表明,Hik33敲除突變體可以更好的利用葡萄糖,而且最有可能通過上調(diào)OPP途徑的關(guān)鍵酶蛋白來實(shí)現(xiàn)這一目的,但與此同時(shí),由于Hik33本身缺失引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激反應(yīng)并沒有消除�；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)和表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們提出了一個(gè)模型來解釋在光合混合營養(yǎng)生長(zhǎng)條件下葡萄糖在Hik33缺失突變體中分解代謝的途徑。在野生型細(xì)胞中,正如前人使用13C標(biāo)記的葡萄糖進(jìn)行的代謝通量分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示,經(jīng)過OPP途徑代謝的碳流量幾乎可以忽略不計(jì)。然而,在Hik33突變體細(xì)胞中,OPP變成了葡萄糖降解利用的主要途徑,或者至少部分提供了用于C02同化的NADPH和RuBP。3. △Hik33通過調(diào)控PetE和PetJ的差異性表達(dá)實(shí)現(xiàn)高濃度C02培養(yǎng)條件下快速生長(zhǎng)在培養(yǎng)Hik33缺失突變體時(shí)發(fā)現(xiàn),向培養(yǎng)液中額外補(bǔ)充5%濃度的CO2氣體,可顯著提高Hik33突變體的生長(zhǎng)。為了探究hik33缺失突變體在光合受損及NADPH供應(yīng)量不足的情況下CO2的固定策略,我們?cè)谂囵B(yǎng)過程中額外補(bǔ)充過量CO2 (5%),定量比較該培養(yǎng)條件下Hik33突變體與野生型細(xì)胞蛋白質(zhì)組水平的差異,以期揭示藍(lán)藻在光系統(tǒng)受損情況下(如Hik33突變體)NADPH供應(yīng)及C02同化策略。與在正常培養(yǎng)條件下Hik33突變體和野生型細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)相比較,高濃度CO2培養(yǎng)條件并沒有大范圍改變突變體和野生型細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平,但同時(shí)也存在個(gè)別變化顯著的蛋白。如CupB、NdhD4、PetE和PetJ。雖然CupB和NdhD4表達(dá)水平的變化預(yù)示著C02可獲得性的變化,但這些變化并不能促進(jìn)Hik33突變體的光自養(yǎng)生長(zhǎng)。在藍(lán)藻中,光合電子傳遞鏈(photosynthetic electron transport,PET)和呼吸電子傳遞鏈(respiratory electron transport,RET)均位于類囊體膜上,兩個(gè)電子傳輸鏈彼此相互交織并且共享幾個(gè)共同組分,例如,質(zhì)體醌,細(xì)胞色素b6/f符合體和可溶性電子載體等。因此,不產(chǎn)生NADPH的RET可能與PET在內(nèi)囊體膜電子流分配上存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。PetE和PetJ是藍(lán)藻細(xì)胞中僅有的兩個(gè)可以將電子從細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體傳遞到光系統(tǒng)Ⅰ和/或呼吸電子傳遞鏈末端氧化酶的可溶性電子載體。正常培養(yǎng)條件下,與野生型細(xì)胞相比,這兩個(gè)蛋白在Hik33突變體中的表達(dá)量并沒有太大變化,說明在普通培養(yǎng)條件下Hik33缺失突變體中,PetE和PetJ并沒有被誘導(dǎo)或抑制表達(dá)。然而,在高濃度CO2培養(yǎng)條件下,與野生型集胞藻細(xì)胞相比Hik33缺失突變體中PetE蛋白的表達(dá)量出現(xiàn)了顯著上調(diào),而PetJ的表達(dá)量卻顯著下調(diào)。PetE的上調(diào)和PetJ的下調(diào)可能揭示了 Hik33缺失突變體在高濃度CO2培養(yǎng)條件下實(shí)現(xiàn)快速生長(zhǎng)的策略。在此條件下,CO2的可獲得性已經(jīng)不再是突變體生長(zhǎng)的主要限制因素,但突變體的快速生長(zhǎng)仍需要光合作用提供大量的NADPH用于CO2的固定。然而,突變體中主要光合機(jī)元件,如PsbO, PBS和PSI的下調(diào)并沒有因高濃度CO2的培養(yǎng)條件而顯著改變,NADPH的產(chǎn)生依賴于光系統(tǒng)的光電子傳遞,因此這仍構(gòu)成了突變體實(shí)現(xiàn)高速生長(zhǎng)的瓶頸�？朔@個(gè)瓶頸的一個(gè)潛在的方法便是通過控制類囊體膜上電子傳遞的流向,使其盡可能少的流向呼吸電子傳遞鏈而最大化流向光合電子傳遞鏈,并用于NADPH生產(chǎn)。由于光合電子傳遞鏈和呼吸電子傳遞鏈都定位在類囊體膜上,且共享相同的兩個(gè)可溶性電子傳遞載體PetE和PetJ。在高濃度C02培養(yǎng)條件下,與野生型藻細(xì)胞相比,Hik33突變體中顯著上調(diào)的PetE和顯著下調(diào)的PetJ可能致使類囊體膜上的電子大量流向光合電子傳遞鏈的PSI而非呼吸電子傳遞鏈的末端氧化酶,這便可以為光合電子傳遞鏈提供充足的電子,進(jìn)而產(chǎn)生充足的NADPH供應(yīng)藻細(xì)胞固定CO2使用。
【圖文】：

大量研究表明植物的葉綠極有可能是由藍(lán)藻的類囊體的片層結(jié)構(gòu)演化而來逡逑（２０）。不過像藍(lán)藻這樣光合作用和呼吸作用同時(shí)存在于相同的膜系統(tǒng)上的物種是逡逑不多見的。藍(lán)藻類囊體膜上的主要光合復(fù)合物結(jié)構(gòu)示意圖如圖１－２所示。逡逑１６逡逑

光合作用僅發(fā)生在類囊體膜上，而呼吸作用既存在于類囊體膜上，，又存在于細(xì)胞逡逑質(zhì)膜上（６，９－１１）。逡逑圖１－１：藍(lán)藻的細(xì)胞的結(jié)構(gòu)圖（６）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－１：邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｖｅｒｖｉｅｗ邋ｏｆ邋ａ邋ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｃｅｌｌ．逡逑１．１．２藍(lán)藻的光合作用逡逑藍(lán)藻的光合作用主要發(fā)生在類囊體膜，同時(shí)類囊體膜也是呼吸作用及其它生逡逑理代謝的重要場(chǎng)所（８）。與高等植物類似，藍(lán)藻可進(jìn)行產(chǎn)氧光合作用（１２）。存在于逡逑類囊體膜上的光合蛋白復(fù)合物有藻膽體（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅ）邋（１３）、光系統(tǒng)ＩＩ復(fù)合物逡逑（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ邋ＩＩ）（１４，１５）、細(xì)胞色素邋ｂ６ｆ邋復(fù)合體（１６）、光系統(tǒng)邋Ｉ邋復(fù)合物（ｐｈｏｔｏｓｙｓｔｅｍ逡逑Ｉ）邋（１７）和ＡＴＰ合酶等（１８，１９）。光驅(qū)動(dòng)的電子傳遞鏈貫穿于整個(gè)類囊體膜，與植物逡逑的光合作用的電子傳遞鏈非常相似，只是在蛋白復(fù)合物的組成上有些差別。實(shí)際逡逑上，大量研究表明植物的葉綠極有可能是由藍(lán)藻的類囊體的片層結(jié)構(gòu)演化而來逡逑（２０）。不過像藍(lán)藻這樣光合作用和呼吸作用同時(shí)存在于相同的膜系統(tǒng)上的物種是逡逑不多見的。藍(lán)藻類囊體膜上的主要光合復(fù)合物結(jié)構(gòu)示意圖如圖１－２所示。逡逑１６逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q946


本文編號(hào)：2550546