【摘要】：乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)作為一種優(yōu)秀的外源蛋白表達(dá)宿主菌,它在食品工業(yè)和制藥工業(yè)里蛋白產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)中有著重要的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)室前期研究中,構(gòu)建了海棲熱袍菌耐熱木聚糖酶工程菌K. lactis GKX31。當(dāng)目的蛋白表達(dá)量提高時(shí),細(xì)胞壁合成相關(guān)基因KIGAS1-1、分子伴侶蛋白基因KIER01和KIKAR2以及UPR反應(yīng)相關(guān)基因KIGCN4的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化。在本研究中分別采用基因敲除和基因過(guò)表達(dá)的策略探討宿主菌改變對(duì)異源蛋白合成、修飾及分泌過(guò)程產(chǎn)生的影響。通過(guò)氨基酸序列分析和三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明,乳酸克魯維酵母中的KIGAS1-1基因和KIGAS1-2基因產(chǎn)物與釀酒酵母中細(xì)胞壁合成相關(guān)的β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶基因GAS1的基因產(chǎn)物的相似性分別為67%和64%,它們都具有一個(gè)葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域Glyco_hydro_72以及一個(gè)與糖類結(jié)合功能相關(guān)的X8結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)兩基因編碼的產(chǎn)物具有β-1,3-葡聚糖基轉(zhuǎn)移酶功能,并在乳酸克魯維酵母細(xì)胞壁合成中發(fā)揮作用。利用同源雙交換的方法,成功構(gòu)建了KIGAS1-1敲除突變株K. lactis Kl-1、KlGAS1-2敲除突變株K. lactis K1-2以及雙敲除突變株K. lactis KD。KIGAS1-1、KIGAS1-2兩基因的敲除不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和細(xì)胞形態(tài),而雙敲除會(huì)使菌株生長(zhǎng)滯后并且細(xì)胞變?yōu)榍蛐纬霈F(xiàn)異常膨大現(xiàn)象。通過(guò)透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),敲除KIGAS1-1會(huì)使細(xì)胞壁厚度減小,而敲除KIGAS1-2產(chǎn)生了相反的表型變化使細(xì)胞壁厚度增大。熒光定量PCR技術(shù)分析,發(fā)現(xiàn)KIGAS1-1、KIGAS1-2和KIGAS3是乳酸克魯維酵母在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)過(guò)程中主要表達(dá)的KIGAS家族基因。KIGAS1-1、KIGAS1-2以及其他KIGAS家族基因在轉(zhuǎn)錄水平上存在互補(bǔ)作用。KIGAS家族基因的整體表達(dá)水平?jīng)Q定了各菌株細(xì)胞在形態(tài)、生長(zhǎng)和細(xì)胞壁厚度上的差異。KIGAS1-1和KIGAS1-2基因的敲除能夠影響乳酸克魯維酵母外源蛋白分泌。KIGAS1-1基因單敲除和兩基因雙敲除能夠提高外源蛋白分泌量(分別提高17.7%和11.5%),而KIGAS1-2基因單敲除則會(huì)降低外源蛋白分泌量(降低35.6%)。KIGAS1-1和KIGAS1-2基因的敲除能夠改變菌株中多個(gè)與蛋白分泌和運(yùn)輸過(guò)程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。各菌株中外源蛋白分泌效率的差異與菌株內(nèi)蛋白分泌和運(yùn)輸過(guò)程相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化之間存在相關(guān)性。推測(cè)轉(zhuǎn)錄水平提高的蛋白分泌和運(yùn)輸過(guò)程相關(guān)基因能夠促進(jìn)外源蛋白的分泌。綜合考慮,K1-1是一種較好的外源蛋白“超分泌”型菌株,敲除KIGAS1-1基因是一種更有效的通過(guò)改造細(xì)胞壁提高外源蛋白分泌水平的方案。使用‘'DNA Multimer直接轉(zhuǎn)化法”構(gòu)建了過(guò)表達(dá)載體pRS426-Gk,進(jìn)而分別構(gòu)建了KlERO1, KIKAR2和KIGCN4過(guò)表達(dá)菌株K. lactis GKERO、K. lactis GKKAR和K. lactis GKGCN。通過(guò)比較細(xì)胞生長(zhǎng)和耐熱木聚糖酶B產(chǎn)量等方面的差異,發(fā)現(xiàn)KIERO1、KlKAR2及KIGCN4的過(guò)表達(dá)都會(huì)使菌株細(xì)胞的生長(zhǎng)滯后,KIERO1和K1KAR2的過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)外源蛋白的分泌(分別提高33.6%和14.1%),而KIGCN4的過(guò)表達(dá)則不能促進(jìn)外源蛋白的分泌。發(fā)現(xiàn)在外源蛋白分泌水平相對(duì)較低的菌株中KICOG6、KlIMH1、KICUP5的表達(dá)量相對(duì)較高。推測(cè)分泌蛋白向液泡的運(yùn)輸及降解是制約外源蛋白產(chǎn)量提高的瓶頸因素,為進(jìn)一步對(duì)乳酸克魯維酵母工程菌進(jìn)行改造提高外源蛋白分泌提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q93
，

本文編號(hào)：2542997