【摘要】：原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells, PGCs)是動(dòng)物體內(nèi)生殖細(xì)胞的前體細(xì)胞,其在生成之后會(huì)沿著特定的路徑向生殖嵴進(jìn)行遷移,并在到達(dá)生殖嵴后相繼分化成雌性或雄性配子。在此過程中,PGCs準(zhǔn)確到達(dá)生殖嵴是其最終分化成配子的前提條件之一。因此,遷移過程的準(zhǔn)確性和精確性決定了PGCs的最終命運(yùn),也影響著機(jī)體的某些特定生理功能。動(dòng)物體內(nèi)PGCs的遷移異常會(huì)引起性原細(xì)胞的功能失調(diào),影響機(jī)體的可育性,導(dǎo)致睪丸生殖細(xì)胞瘤等腫瘤的產(chǎn)生。PGCs在機(jī)體內(nèi)的遷移過程受到趨化因子受體4(Chemokine receptor 4, CXCR4)等多種因子的聯(lián)合調(diào)控。而在之前對(duì)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白3(Reticulon 3, RTN3)的功能研究又大多集中在細(xì)胞凋亡以及神經(jīng)退行性疾病等方面。本研究在探究影響PGCs遷移的因子及其作用機(jī)制過程中,發(fā)現(xiàn)RTN3可能參與調(diào)控PGCs的遷移過程。首先通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)了RTN3與CXCR4在酵母細(xì)胞中具有蛋白間的相互作用,在HEK293細(xì)胞中進(jìn)行的免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, co-IP)實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了兩者間這一相互作用的存在。為了進(jìn)一步分析影響這一蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域信息,本研究通過構(gòu)建RTN3結(jié)構(gòu)域缺失載體并利用HEK293細(xì)胞進(jìn)行co-IP分析,證明RTN3的C端保守結(jié)構(gòu)域RHD是與CXCR4相互作用的重要功能區(qū)。為了進(jìn)一步了解RTN3與CXCR4的作用關(guān)系,本研究首先通過熒光定量PCR和Western blot方法在HEK293細(xì)胞中檢測(cè)了RTN3對(duì)CXCR4表達(dá)的影響。結(jié)果表明RTN3能夠正調(diào)控CXCR4的表達(dá),在過表達(dá)外源RTN3或敲低內(nèi)源RTN3的情況下,內(nèi)源CXCR4在mRNA水平和蛋白水平都會(huì)發(fā)生相應(yīng)的上調(diào)或下調(diào)。隨后在HeLa細(xì)胞進(jìn)行的免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明,RTN3還能夠使CXCR4蛋白的亞細(xì)胞定位發(fā)生變化。正常狀態(tài)下,CXCR4具有明顯的細(xì)胞膜定位,并且分布較為均一,在RTN3過表達(dá)情況下,膜定位的CXCR4顯著減少并發(fā)生了點(diǎn)狀聚集,這些點(diǎn)狀聚集與RTN3具有明顯的共定位。這些結(jié)果暗示RTN3可能同時(shí)通過調(diào)控CXCR4的表達(dá)和亞細(xì)胞定位進(jìn)而影響其某些生物學(xué)功能的行使。為了研究RTN3在PGCs遷移過程中的作用,本研究利用顯微注射技術(shù)在斑馬魚胚胎中過表達(dá)了RTN3和CXCR4b,并觀察其對(duì)PGCs遷移的影響。結(jié)果表明,RTN3過表達(dá)能夠顯著影響斑馬魚PGCs的遷移,使PGCs概率性的出現(xiàn)在生殖嵴以外的隨機(jī)位置,說明在RTN3過表達(dá)情況下斑馬魚的PGCs遷移過程受到干擾,從而出現(xiàn)了遷移異位。這些表型與在斑馬魚胚胎中過表達(dá)CXCR4b的表型非常相似。綜上所述,本研究分別以酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞(HEK293和HeLa細(xì)胞)以及斑馬魚模式生物為研究材料,揭示了RTN3與CXCR4的作用關(guān)系和調(diào)控方式,驗(yàn)證了RTN3在調(diào)控斑馬魚PGCs遷移過程中的重要作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步了解RTN3的生物學(xué)功能及其對(duì)PGCs遷移調(diào)控機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q78;Q492

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 林勝男;張育輝;;原始生殖細(xì)胞增殖調(diào)控的研究進(jìn)展[J];解剖學(xué)雜志;2008年03期

2 肖小s，

本文編號(hào)：2534068