【摘要】：原始生殖細胞(Primordial germ cells, PGCs)是動物體內生殖細胞的前體細胞,其在生成之后會沿著特定的路徑向生殖嵴進行遷移,并在到達生殖嵴后相繼分化成雌性或雄性配子。在此過程中,PGCs準確到達生殖嵴是其最終分化成配子的前提條件之一。因此,遷移過程的準確性和精確性決定了PGCs的最終命運,也影響著機體的某些特定生理功能。動物體內PGCs的遷移異常會引起性原細胞的功能失調,影響機體的可育性,導致睪丸生殖細胞瘤等腫瘤的產生。PGCs在機體內的遷移過程受到趨化因子受體4(Chemokine receptor 4, CXCR4)等多種因子的聯合調控。而在之前對于內質網蛋白3(Reticulon 3, RTN3)的功能研究又大多集中在細胞凋亡以及神經退行性疾病等方面。本研究在探究影響PGCs遷移的因子及其作用機制過程中,發(fā)現RTN3可能參與調控PGCs的遷移過程。首先通過酵母雙雜交實驗,我們發(fā)現了RTN3與CXCR4在酵母細胞中具有蛋白間的相互作用,在HEK293細胞中進行的免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, co-IP)實驗也證實了兩者間這一相互作用的存在。為了進一步分析影響這一蛋白相互作用的結構域信息,本研究通過構建RTN3結構域缺失載體并利用HEK293細胞進行co-IP分析,證明RTN3的C端保守結構域RHD是與CXCR4相互作用的重要功能區(qū)。為了進一步了解RTN3與CXCR4的作用關系,本研究首先通過熒光定量PCR和Western blot方法在HEK293細胞中檢測了RTN3對CXCR4表達的影響。結果表明RTN3能夠正調控CXCR4的表達,在過表達外源RTN3或敲低內源RTN3的情況下,內源CXCR4在mRNA水平和蛋白水平都會發(fā)生相應的上調或下調。隨后在HeLa細胞進行的免疫熒光實驗表明,RTN3還能夠使CXCR4蛋白的亞細胞定位發(fā)生變化。正常狀態(tài)下,CXCR4具有明顯的細胞膜定位,并且分布較為均一,在RTN3過表達情況下,膜定位的CXCR4顯著減少并發(fā)生了點狀聚集,這些點狀聚集與RTN3具有明顯的共定位。這些結果暗示RTN3可能同時通過調控CXCR4的表達和亞細胞定位進而影響其某些生物學功能的行使。為了研究RTN3在PGCs遷移過程中的作用,本研究利用顯微注射技術在斑馬魚胚胎中過表達了RTN3和CXCR4b,并觀察其對PGCs遷移的影響。結果表明,RTN3過表達能夠顯著影響斑馬魚PGCs的遷移,使PGCs概率性的出現在生殖嵴以外的隨機位置,說明在RTN3過表達情況下斑馬魚的PGCs遷移過程受到干擾,從而出現了遷移異位。這些表型與在斑馬魚胚胎中過表達CXCR4b的表型非常相似。綜上所述,本研究分別以酵母菌、哺乳動物細胞(HEK293和HeLa細胞)以及斑馬魚模式生物為研究材料,揭示了RTN3與CXCR4的作用關系和調控方式,驗證了RTN3在調控斑馬魚PGCs遷移過程中的重要作用。這些結果為進一步了解RTN3的生物學功能及其對PGCs遷移調控機制的研究提供了理論依據。
【學位授予單位】：中國農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q78;Q492

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1 林勝男;張育輝;;原始生殖細胞增殖調控的研究進展[J];解剖學雜志;2008年03期

2 肖小s，

本文編號：2534068