【摘要】：由于科學(xué)家對蠑螈的肢體再生能力興趣,哺乳類和人類的心臟再生科學(xué)被密切研究了一百多年。直到最近,這門學(xué)科被認(rèn)為如同科幻小說一般。再過去的二十年間,由于干細(xì)胞科學(xué)的極大創(chuàng)新以及其在心臟再生中的應(yīng)用潛能,心臟再生醫(yī)學(xué)得以復(fù)興。最新的突破性報(bào)導(dǎo)驚人地展現(xiàn)出新生小鼠類心臟的再生活力。這個發(fā)現(xiàn)顛覆了傳統(tǒng)的觀念并指引臨床應(yīng)用新的希望。盡管如此,內(nèi)源性心臟修復(fù)的機(jī)制并不明確。在這個課題中,我們研究了新生心肌在心臟生長和再生中的特性。我們工作首次揭示出新生心肌的異質(zhì)性證據(jù),即心臟中存在對心臟再生貢獻(xiàn)大于其他心肌細(xì)胞的亞群。我們的研究同時提供了新的心肌再生研究焦點(diǎn)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為出生后的心臟通過心肌細(xì)胞肥大得以生長。然而,我們的組織學(xué)結(jié)果和這個觀點(diǎn)沖突。因?yàn)槲覀儼l(fā)現(xiàn)心臟組織的體積和心肌細(xì)胞的大小不成線性化的增長。通過BrdU介導(dǎo)的族系示蹤,我們觀察到約40%的青年心臟組織來源于原有心臟細(xì)胞的增殖。免疫熒光結(jié)果顯示出新生心肌細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞周期的標(biāo)記物,擁有放射狀的緊湊染色質(zhì)并表現(xiàn)出旺盛的增殖活性。有趣的是,絕大多數(shù)的增殖的心肌細(xì)胞都表現(xiàn)出肌鈣蛋白在細(xì)胞膜下定位的表型。這些細(xì)胞我們稱為mT-CMs(細(xì)胞膜肌鈣蛋白T定位的心肌細(xì)胞)。分子學(xué)證據(jù)表明mT-CM亞群的這種特殊表型并不是因?yàn)榧?xì)胞有絲分裂過程中細(xì)胞骨架的解聚造成的。這些mT-C M細(xì)胞可能是有絲分裂過程中的普通心肌細(xì)胞,或者是一個介導(dǎo)新生新生肌發(fā)育的特殊亞群。前者的假設(shè)暗示著心肌細(xì)胞的增殖是一種隨機(jī)事件。其結(jié)果導(dǎo)致心臟組織中散布的心肌細(xì)胞增殖。然而,BrdU派沖式細(xì)胞示蹤結(jié)果顯示新生發(fā)育心臟中存在小的心肌細(xì)胞群落。在單張組織切片層面上,這些群落通常由多于5個相鄰細(xì)胞組成,而并不是散在的單個細(xì)胞。這個證據(jù)表明新生心臟中存在單個細(xì)胞來源心肌細(xì)胞群落。同時暗示,這些群落可能是由于某個新生心肌亞群的增殖。這個亞群和一般的心肌不同。我們認(rèn)為可能是mT-CM亞群。為了進(jìn)一步確認(rèn)BrdU標(biāo)記的肌細(xì)胞群落都分別來自單個心肌細(xì)胞,我們適用了時空可誘導(dǎo)的遺傳學(xué)示蹤技術(shù)。通過脈沖式的Tamoxifen處理,我們的系統(tǒng)足以靈敏到標(biāo)記出單個體內(nèi)細(xì)胞。單細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)展現(xiàn)出了新生可增殖心肌細(xì)胞的克隆形成能力。通常,示蹤的群落都有大于十個的心肌細(xì)胞組成。這些細(xì)胞都來自于原始的單個心肌細(xì)胞。令人吃驚的是,盡管青年時期的心臟對急性損傷的再生應(yīng)答能力十分微弱,我們在青年的心臟組織中觀察到了相同的現(xiàn)象。這些證據(jù)進(jìn)一步暗示這一個特殊的心肌亞群,可能是]mT-CMs田胞,表現(xiàn)出了持續(xù)性的細(xì)胞增殖,并為心臟生成提供細(xì)胞資源。相比較普通的心肌細(xì)胞,mT-CM細(xì)胞同樣表現(xiàn)出獨(dú)有的分子特征。mT-CM細(xì)胞并不表達(dá)心臟祖細(xì)胞或者干細(xì)胞的標(biāo)記物。這個結(jié)果表明mT-CM細(xì)胞不是干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化過程中的中間態(tài)細(xì)胞。細(xì)胞核蛋白免疫沉淀結(jié)果顯示新生心室組織具有高豐度的細(xì)胞核內(nèi)P-catenin蛋白。這個狀態(tài)雖時間逐漸減弱。免疫熒光圖像進(jìn)一步確認(rèn)細(xì)胞核內(nèi)的(3-catenin信號特異地定位在mT-CM亞群中。然而,我們并沒有觀察到經(jīng)典Wnt信號通路下游地靶基因表達(dá)。需要更多的證據(jù)用于闡明非經(jīng)典Wnt信號通路在mT-CM細(xì)胞增殖中的作用。值得注意的是,mT-CM細(xì)胞特異表達(dá)胚胎期心臟發(fā)生關(guān)鍵基因GATA4。遺傳學(xué)的證據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)了這個觀察。我們認(rèn)為GATA4很可能是一個標(biāo)記新生心肌中mT-CM亞群的分子標(biāo)記物。功能學(xué)的證據(jù)進(jìn)一步確認(rèn)了mT-CM亞群在新生心肌細(xì)胞中的存在。心臟再生的分析結(jié)果顯示nT-CM細(xì)胞較于一般心肌細(xì)胞擁有不同的心肌新生能力。通過長期的可誘導(dǎo)遺傳族系示蹤,我時間特異地標(biāo)記出了新生增殖地心肌細(xì)胞(假定為mT-CM細(xì)胞)并且研究了其在心臟再生中的細(xì)胞行為和族系貢獻(xiàn)。在心臟修復(fù)過程中,我們觀察到一大部分標(biāo)記的心肌細(xì)胞重新回到新生心肌的狀態(tài),表現(xiàn)出肌鈣蛋白和骨架蛋白的細(xì)胞膜內(nèi)定位的特點(diǎn)。相同的表現(xiàn)被其他的實(shí)驗(yàn)組在多種動物模型中報(bào)導(dǎo)過,并且由于和細(xì)胞分裂標(biāo)記物表達(dá)的線性關(guān)系被認(rèn)為是一種細(xì)胞增殖的特性。再則,在梗死心臟組織修改過程中,標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)量明顯增加。有一部分細(xì)胞根據(jù)其規(guī)則的肌小結(jié)結(jié)構(gòu)被鑒定為心肌細(xì)胞。盡管脈沖式的長時期細(xì)胞示蹤無法標(biāo)記出新生心臟中所以的增殖心肌細(xì)胞,統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果仍然驚人的顯示標(biāo)記的新生增殖心肌族系對新生心肌組織生成的巨大作用。這個證據(jù)證明了被標(biāo)記的可增殖心肌細(xì)胞亞群和一般心肌比較,貢獻(xiàn)給了心臟再生主要的細(xì)胞資源�？偨Y(jié),我們定性出了一個新的心肌細(xì)胞亞群。這個亞群向較于普通心肌細(xì)胞擁有更強(qiáng)的細(xì)胞增殖活性并且對心臟生長和再生起到重要作用。
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q593

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本文編號：2528987