發(fā)布時間：2019-08-15 10:24

【摘要】：鐵作為許多功能蛋白的重要輔助因子,對于植物的生長發(fā)育起著極其重要的作用。在人類中,缺鐵是引起人類貧血癥的主要原因之一,而植物性食物是人類獲得鐵的主要來源,因此研究植物體內(nèi)鐵的吸收,轉(zhuǎn)運(yùn)以及調(diào)控的機(jī)制是非常重要的。bHLH38/39/100/101是四個調(diào)控?cái)M南芥缺鐵響應(yīng)的重要基因,但它們是如何被缺鐵信號激活的還不清楚。為此,我們以bHLH101的啟動子為誘餌進(jìn)行酵母單雜交實(shí)驗(yàn)。通過篩選,我們鑒定到一個bHLH蛋白,bHLH34,它可以直接結(jié)合到bHLH101的啟動子上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),bHLH34的同源蛋白bHLH104也可以結(jié)合到bHLH101的啟動子上。這暗示bHLH34和bHLH104可能也參與植物的缺鐵響應(yīng)調(diào)控。為了證實(shí)我們的推測,我們從擬南芥種質(zhì)資源中心獲得了bHLH34和bHLH104兩個基因的T-DNA插入突變體,通過RT-PCR鑒定,兩個突變體都是缺失突變體�？紤]到bHLH34和bHLH 104可能存在功能冗余性,我們又通過雜交構(gòu)建了bhlh34bhlh104雙突變體。表型分析發(fā)現(xiàn),在缺鐵條件下,bhlh34,bhlh104單突變體和bhlh34bhlh104雙突變體都表現(xiàn)出了典型的缺鐵癥狀,即葉子的黃化和根的生長抑制現(xiàn)象,其中bhlh34bhlh104雙突變體的缺鐵癥狀最為嚴(yán)重。為了進(jìn)一步驗(yàn)證bHLH34和bHLH104的功能,我們設(shè)計(jì)了一個人工microRNA,amiR-bhlh34/104,它可以同時特異性的靶向bHLH34和bHLH104兩個基因。我們構(gòu)建了amiR-bhlh34/104轉(zhuǎn)基因植株,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在缺鐵條件下也表現(xiàn)出了典型的缺鐵癥狀,其表型與bhlh34bhlh104雙突變體類似,這說明amiR-bhlh34/104轉(zhuǎn)基因植株模擬了bhlh34bhlh104雙突變體的表型。鐵還原酶活性的升高是植物缺鐵的一個典型指標(biāo),因此我們檢測了野生型和突變體的鐵還原酶活性。在缺鐵條件下,野生型植株和突變體的鐵還原酶活性都顯著升高,但是突變體的鐵還原酶活性遠(yuǎn)低于野生型,而且bhlh34bhlh104雙突變體的鐵還原酶活性最低。鐵含量檢測表明,無論在鐵充足還是鐵缺少的情況下,bhlh34bhlh104雙突變體根和葉的鐵含量都顯著低于野生型。為了揭示bHLH34和bHLH 104的分子調(diào)控機(jī)制,我們分析了缺鐵響應(yīng)基因的表達(dá)情況。鐵吸收直接相關(guān)的兩個基因IRT1和FRO2以及正調(diào)控植物缺鐵響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子MYB10, MYB72,bHLH38/39/100/101和FIT在突變體中都下調(diào)。這說明bHLH34和bHLH 104正調(diào)控缺鐵響應(yīng)。為了證實(shí)是否提高bHLH34和bHLH104的表達(dá)水平可以促進(jìn)鐵的吸收,我們構(gòu)建了bHLH34和bHLH104的高表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。大約10%的bHLH34高表達(dá)株系和33%的bHLH104高表達(dá)株系表現(xiàn)出植株矮小,老葉壞死的癥狀,而其余株系則沒有明顯表型。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),高表達(dá)株系積累了高水平的鐵含量,并且大幅上調(diào)了缺鐵響應(yīng)基因的表達(dá),這說明bHLH34和bHLH104的確是正調(diào)控缺鐵響應(yīng)的。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)表明bHLH101可能是bHLH34和bHLH104的直接靶基因。bHLH38/39/100是bHLH101的同源基因,并且它們都受到缺鐵環(huán)境的強(qiáng)烈誘導(dǎo),因此,我們猜測bHLH38/39/100/101可能都受到bHLH34和bHLH104的直接調(diào)控。為了證實(shí)該猜想,我們設(shè)計(jì)了一個effector-reporter瞬時表達(dá)系統(tǒng)。將bHLH38/39/100/101的啟動子分別與含有核定位信號的GFP融合作為reporter,將bHLH34或bHLH104與CaMV35S啟動子融合作為effector。瞬時共表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,bHLH34和bHLH104可以特異性地激活bHLH38/39/100/101的啟動子,但不能激活FIT的啟動子。這說明bHLH38/39/100/101都是bHLH34和bHLH104的靶基因。通過在bhlh34bhlh104雙突變體的背景下高表達(dá)bHLH101,我們發(fā)現(xiàn)bhlh34bhlh104雙突變體的缺鐵癥狀得到了明顯的緩解。基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),這些轉(zhuǎn)基因植株中IRT1和FR02的表達(dá)比bhlh34bhlh104雙突變體顯著提高,說明bHLH101的高表達(dá)可以部分互補(bǔ)bhlh34bhlh104雙突變體的表型。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn),雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)同時證明了bHLH34和bHLH104可以互作形成異源二聚體。另外,我們又進(jìn)一步通過酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)bHLH34, bHLH104和bHLH105任意兩者之間都可以形成異源二聚體,它們也都可以與自身形成同源二聚體。為了進(jìn)一步闡釋這三個基因的關(guān)系,我們構(gòu)建了兩個雙突變體bhlh34bhlh105和bhlh104bhlh105。我們發(fā)現(xiàn)bhlh34bhlh104,bhlh34bhlh105和bhlh104bhlh105三種雙突變體的表型比bhlh34, bhlh104和bhlh105三種單突變體中任何一個的表型都更加嚴(yán)重,說明bHLH34, bHLH104和bHLH105這三個基因的功能是相互疊加的,而不是冗余的。此外,我們也觀察到ProbHLH34:GUS, ProbHLH104:GUS和ProbHLH105:GUS在根和下胚軸具有不同的表達(dá)模式,這也許可以解釋它們功能上的非冗余性。我們的工作表明bHLH34和bHLH104轉(zhuǎn)錄因子通過介導(dǎo)bHLH38/39/100/101基因的轉(zhuǎn)錄從而正調(diào)控?cái)M南芥的缺鐵響應(yīng),并且增加bHLH34和bHLH104的表達(dá)水平足以提高植物的鐵含量,這也為通過基因工程方法提高農(nóng)作物的鐵含量提供了一個新思路。
【圖文】：

植物不僅要維持組織及細(xì)胞水平的鐵平衡，同時也得維持細(xì)胞器之間的鐵平逡逑衡。一旦被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，鐵必須被合理的分配到細(xì)胞器如線粒體，葉綠體等進(jìn)逡逑行生命活動或者被存儲在液泡中（ＪｅｏｎｇａｎｄＧｕｅｒｉｎｏｔ２００９；圖１．５）。鐵在細(xì)胞器中逡逑的過多積累或者缺失也同樣會對植物體造成嚴(yán)重傷害。逡逑＾Ｒ０３邋＾ＦＲ0８邐ＦＲ０７邐＼逡逑Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ＂邐ｉ邋４邋Ｎｒａｍｐ３逡逑＼邋ｅ－Ｓ邐ｙ逡逑Ｆｅ２＊邋Ｊ＾＾ＺＩＰｓ邐＾ｊｙｖｉＴＩ邋／邐／逡逑Ｆｅ＾－逡逑ｍｅｍｂｒａｎｅ邋＾邐逡逑圖１．５參與植物細(xì)胞內(nèi)鐵的運(yùn)輸?shù)姆肿游镔|(zhì)（Ｊｅｏｎｇ邋ａｎｄ邋Ｇｕｅｒｉｎｏｔ邋２００９）逡逑１．２．邐２．邋３．１邋液泡逡逑液泡是植物細(xì)胞內(nèi)重要的鐵的存儲場所，對于種子中鐵的儲存尤為重要。酵逡逑母邋ＳｃＣＣＣｌ邋（Ｃａ２＋－ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ邋ｃｒｏｓｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｅｒｌ）蛋白負(fù)責(zé)液泡內(nèi)邋Ｆｅ邋和邋Ｍｎ邋的轉(zhuǎn)運(yùn)，逡逑它的突變體ＳＣＣＣＣ７不能在鐵過量的培養(yǎng)基上生長，因?yàn)椋樱茫茫茫�；突變體不能將鐵逡逑儲存到液泡中，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中的鐵過量而對細(xì)胞造成毒害（Ｌｉ邋ｅｔａｌ．邋２００１）。ＳｃＣＣＣｌ逡逑在擬南芥中的同源蛋白ＶＩＴｌ（Ｖａｃｕｏｌａｒ邋Ｉｒｏｎ邋Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ邋１）可Ｗ互補(bǔ)突變體逡逑的表型，，并且提高了酵母細(xì)胞液泡中的鐵含量，降低了細(xì)胞質(zhì)中的鐵含量，說明逡逑￥阿

６ＷＷ４和６／１化Ｗ突變體的Ｔ－ＤＮＡ插入位置，其中黑色矩形表示編碼區(qū)，逡逑灰色矩形表示非翻譯區(qū)，＝角形表示Ｔ－ＤＮＡ插入位置ｉ邋Ｂ，ＲＴ－ＰＣＲ鑒定突變體中逡逑全長ｃＤＮＡ的表達(dá)情況；Ｃ，各種突變體在＋Ｆｅ板和Ｆｅ板生長１０天的表型；Ｄ，逡逑正常主巧中生長４

本文編號：2526937