【摘要】：類膠原蛋白(collagen like protein, CLP)和類彈性蛋白多肽(elastin like polypeptides, ELP)是一類含有高度重復(fù)氨基酸序列的蛋白質(zhì),能夠自組裝成二級或高級結(jié)構(gòu),具備特殊的生物功能,在生物醫(yī)學(xué)材料和組織工程等領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用。本文開展了這一類含特定重復(fù)序列蛋白質(zhì)的高效表達(dá)及在多個領(lǐng)域中的應(yīng)用研究。本文首先開展了類人膠原蛋白(human like collagen, HLC)在大腸桿菌中的重組表達(dá)研究。通過將HLC、脯氨酸羥化酶和D-阿拉伯糖-1,4-內(nèi)酯酶基因同時導(dǎo)入大腸桿菌,實(shí)現(xiàn)了HLC的高效表達(dá)。結(jié)果表明：以MBL為培養(yǎng)基,在優(yōu)化的培養(yǎng)和誘導(dǎo)條件下,搖瓶條件下,重組HLC產(chǎn)量達(dá)到49.55 mg/L。在10L發(fā)酵罐上流加葡萄糖培養(yǎng),重組HLC產(chǎn)量提高到0.26g/L。最后通過親和純化獲得的重組HLC經(jīng)液相測定發(fā)現(xiàn)脯氨酸的羥化率達(dá)到10%。然后,開展在大腸桿菌中表達(dá)類膠原蛋白(化膿鏈球菌Scl2)的研究。將GERGFPGERGVE、GRPGKPGKQGQK和RGD等位點(diǎn)整合進(jìn)入Scl2基因(Scl2-M)并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。在10L發(fā)酵罐上經(jīng)流加甘油,重組Scl2-M的產(chǎn)量提高到15.23g/L。經(jīng)親和純化獲得重組Scl2-M且純度為94.5%,回收率為73.1%,且重組Scl2-M對細(xì)胞THP-1具有良好的粘附作用。進(jìn)一步建立了以Scl2-M為融合標(biāo)簽,純化人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(human basic fibroblast growth factor, hbFGF)的工藝路線。經(jīng)流加甘油,融合蛋白在10L發(fā)酵罐上的產(chǎn)量為11.32g/L,相應(yīng)hbFGF的產(chǎn)量為3.83 g/L。經(jīng)親和純化、酶切和離子交換等步驟,獲得hbFGF和Scl2-M且回收率分別為38.3%和53.4%。最后,經(jīng)MTT法測定發(fā)現(xiàn)20 ng/mL hbFGF就可有效促進(jìn)細(xì)胞NIH3T3的增殖。最后開展利用在大腸桿菌中表達(dá)ELP與L-谷氨酸氧化酶(L-glutamate oxidase, LGOX)融合蛋白質(zhì)的研究。在30 L發(fā)酵罐上對重組菌進(jìn)行分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng),流加甘油后,融合蛋白LGOX-ELP的酶活最高達(dá)74.25 U/mL。利用ELP可逆相變特性獲得LGOX-ELP并經(jīng)蛋白酶K酶切,獲得成熟LGOX,且相對酶活為98.14 U/mg,回收率為64.4%。獲得的LGOX用于催化生產(chǎn)α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG)的研究。首先在3L反應(yīng)器中優(yōu)化了游離酶和固定化酶的催化反應(yīng)條件,在補(bǔ)加底物和過氧化氫酶條件下,a-KG和丁二酸濃度分別為142.5 g/L和18.7 g/L。并在800 L反應(yīng)器中開展了固定化酶的重復(fù)催化研究,結(jié)果表明該固定化酶在800 L反應(yīng)器上可反復(fù)使用25次且a-KG的平均生產(chǎn)速率約為6.08 g/L/h,L-谷氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)94.5%�？傊�,本論文不僅在大腸桿菌中獲得了羥基化的HLC,還進(jìn)一步對Scl2進(jìn)行研究并利用其作為融合標(biāo)簽制備獲得hbFGF。利用ELP可逆相變并結(jié)合蛋白酶K酶切,制備了成熟LGOX并用其催化生產(chǎn)了具有高附加值的α-KG。
【圖文】：

Ｈ聯(lián)體重復(fù)序列組分，其中Ｘａａ通常為脯氨酸，Ｙａａ經(jīng)常為送脯氨酸戎客賴氨酸。逡逑它巧基本結(jié)構(gòu)是原膠原，，k胃鱸涸腫傭加賞跆酰岱裊醋槌�，而k胃觶岱裊炊煎義匣嶁緯勺笫致菪�，览^踝笫致菪ぴ諞黃鸚緯梢桓齟蟮撓沂致菪峁梗ㄍ跡保保�。辶x轄涸鞍椎鬧擲嘍�，结构竻矙熏臍ぐ发现的胶原蛋白诌|儆校玻鋼鄭浠窘徨義瞎谷創(chuàng)笸∫�。胶原蛋白具有支撑器宫、�；せ宓墓δ懿⑶一褂胂赴莞膠拖稿義習(xí)ㄒ樸泄亍ｅ義希懾危懾危懾義希海危懾澹懾義希粒攏緬義賢跡保苯涸鞍椎耐蹺菪峁瑰義希疲椋紓澹保卞澹齲酰恚幔鑠澹悖錚歟歟幔紓澹鑠澹踴酰悖簦酰潁澹簀寤幔翦澹幔潁邋澹觶椋螅酰幔歟椋澹溴澹酰螅椋睿玨澹校模攏哄澹桑攏耍皺澹椋鑠澹簦瑁潁澹邋義希洌椋媯媯澹潁澹睿翦澹媯錚潁恚螅哄澹裕酰猓邋澹ǎ粒�，邋ＣＰＫ邋（n╁澹幔睿溴澹猓幔歟戾澹幔睿溴澹螅簦椋悖脲澹恚錚洌澹戾澹ǎ茫╁義俠嘟涸鞍自蚴歉萁涸鞍椎奶匭越杏嘔蛞胩厥夤δ艿陌被嶁蟈義狹校ü刈楸澩锘竦玫木哂欣嗨平涸鞍滋匭緣牡鞍�。类胶原蛋白具有良好的伭x仙镅噯菪浴⑾赴莞繳�、磧喐胞生长簷E寡裙δ埽氪程崛』竦玫慕涸義

本文編號：2518967