【摘要】：引發(fā)艾滋病的人類免疫缺陷病毒(HIV)具有高度的變異性。全球廣泛傳播的HIV-1分為M群、O群、N群和P群,HIV-1的M群包括9個(gè)亞型、72個(gè)流行重組毒株(CRFs)和無數(shù)獨(dú)特重組毒株(URFs)。HIV-1不僅基因型高度多樣,還有復(fù)雜的表型特征。主要包括復(fù)制能力和生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、致細(xì)胞病變的作用、細(xì)胞嗜性、輔助受體使用和Env蛋白的V3環(huán)頂端氨基酸序列等。這些生物學(xué)表型特征之間有緊密的聯(lián)系,并與HIV-1的致病性、傳播能力、免疫逃逸及疾病進(jìn)程密切相關(guān)。由于可代表體內(nèi)病毒真實(shí)情況的HIV-1臨床分離毒株難以獲得,相對(duì)于基因序列水平的研究,表型研究的難度很大。正因如此,基因型研究獲得的大量提示性結(jié)果也未能在表型層面得到驗(yàn)證。我國(guó)流行的HIV毒株復(fù)雜多樣,主要流行毒株有B(包括Thai-B)、CRF01_AE、CRF07_BC和CRF08_BC這4個(gè)基因型的毒株,還有大量新型重組毒株。目前,由于對(duì)我國(guó)HIV-1流行毒株生物學(xué)表型的研究缺乏,導(dǎo)致我們不能全面理解我國(guó)HIV-1流行毒株的生物學(xué)特征、不能科學(xué)解釋近幾年臨床上發(fā)現(xiàn)的病程速率改變的現(xiàn)象,也極大地影響了疫苗等生物防治方法的研究。CRF07_BC是在我國(guó)云南形成的以C亞型毒株為骨架插入B亞型片段的流行重組毒株,最初主要在吸毒人群中流行,近幾年也擴(kuò)散進(jìn)入性傳播人群特別是男男同性傳播人群,占全國(guó)感染總數(shù)的35.5%。大量研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)毒株具有獨(dú)特的致病特征,例如,感染這個(gè)毒株的人初始CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)相對(duì)較高病程進(jìn)展可能較慢。然而此毒株的感染性和致病性相關(guān)因素目前尚缺乏研究。本研究首先進(jìn)行了我國(guó)HIV-1流行毒株分離培養(yǎng)和全面的生物學(xué)表型特征研究,構(gòu)建了具有充分多樣性的毒株樣本盤,并對(duì)我國(guó)常用的病毒載量和p24抗原檢測(cè)試劑進(jìn)行了評(píng)價(jià)�；谖覀儼l(fā)現(xiàn)的以CRF07_BC為代表的HIV-1C類病毒特有的Rev101提前終止現(xiàn)象,進(jìn)行了Rev-RRE對(duì)復(fù)制和感染影響的研究。以期全面了解我國(guó)HIV-1流行毒株的表型特征,為揭示致病機(jī)制及生物防治研究奠定基礎(chǔ)。第一章我國(guó)HIV-1流行毒株的分離鑒定和表型特征研究我國(guó)流行HIV-1毒株的基因型和表型的多樣性對(duì)病毒傳播和病程進(jìn)展有顯著影響。目前我國(guó)HIV-1多樣性研究大多停留在序列和基因型層面,缺乏生物學(xué)表型研究,病毒表型多樣性與毒力及致病性之間的關(guān)系亟待闡明。另外,hiv-1毒株的多樣性和復(fù)雜性為艾滋病監(jiān)測(cè)和診斷方法的完善,疫苗的研發(fā)和臨床治療帶來了一系列挑戰(zhàn)。目前缺少能代表我國(guó)hiv-1多樣性的毒株樣本盤用于對(duì)相關(guān)檢測(cè)和生物防治方法的適用性評(píng)價(jià)。目的:分離培養(yǎng)我國(guó)流行的hiv-1毒株,對(duì)其復(fù)制能力和表型特征進(jìn)行全面鑒定;建立一組能代表我國(guó)流行hiv-1毒株多樣性并可以用于艾滋病檢測(cè)方法評(píng)估的hiv-1樣本盤。方法和結(jié)果:(1)樣本的采集與病毒的分離培養(yǎng):1)通過我國(guó)hiv-1耐藥監(jiān)測(cè)項(xiàng)目從10個(gè)省市收集48例hiv感染者的新鮮抗凝外周靜脈血液樣本,分離外周血單核細(xì)胞(pbmcs),與健康供血者的pbmcs共培養(yǎng),在生物安全3級(jí)實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)28天,期間定時(shí)補(bǔ)充細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng),獲得我國(guó)2010年至2013年間hiv-1臨床分離株14株。2)對(duì)我實(shí)驗(yàn)室2002年至2009年間初步分離的51株病毒進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),獲得穩(wěn)定傳代的病毒分離株16株。最終共獲得30株高濃度(106-109cp/ml)、大量(40ml)液氮凍存保種的病毒株。分離的病毒包括b(13例),crf01_ae(12例)和crf07_bc(4例)三種我國(guó)廣泛流行的毒株和較為罕見的g亞型(1例)毒株;傳播途徑包括血液傳播(13例)、同性性傳播(8例)、異性性傳播(6例)、靜脈吸毒傳播(1例)及傳播途徑不明(2例)。(2)序列測(cè)定及基因型鑒定:對(duì)病毒基因組進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序,得到6條hiv-1全長(zhǎng)基因組序列、77條gag/pol區(qū)全長(zhǎng)或envc2v3區(qū)序列(分別為25,27和25條),經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)化分析,證實(shí)30例樣本包括如上所述4個(gè)亞型,且crf01_ae毒株分屬于3個(gè)傳播簇。(3)復(fù)制動(dòng)力學(xué)研究:p24抗原濃度大于2ng/ml的11株毒株中3株為相對(duì)快/高型(r/h)復(fù)制毒株,且均有致合胞體形成的能力(si),其中一株crf01_ae亞型的毒株復(fù)制能力極強(qiáng),是參考毒株nl4-3的217倍。(4)通過envv3區(qū)序列預(yù)測(cè)env相關(guān)的表型:1)輔助受體使用:17株為使用ccr5輔助受體的m嗜性毒株,12株為使用cxcr4/ccr5的雙嗜性毒株,有1例無法預(yù)測(cè)�？�/高型復(fù)制且可致合胞體形成(syncytiainducing,si)的4個(gè)毒株都是x4/r5雙嗜性,復(fù)制快/高但不致合胞體形成(non-syncytiainducing,nsi)的sx2010001只使用ccr5輔助受體;2)v3環(huán)頂端四肽包括gpgr,gpgq,gqgr,gpgh和gwgr共5種,復(fù)制相對(duì)較高的5個(gè)毒株的頂端四肽均為gpgr;3)糖基化位點(diǎn):所有毒株的v3環(huán)糖基化位點(diǎn)為8~13個(gè),其中17、30、36、42、98、131和137位為大部分毒株共有的糖基化位點(diǎn),復(fù)制能力相對(duì)較高的5個(gè)毒株中有4個(gè)在第3位出現(xiàn)了n-糖基化,而其他毒株中均未出現(xiàn)此糖基化位點(diǎn),提示可能與病毒的感染和復(fù)制能力相關(guān)。(5)根據(jù)pol區(qū)序列鑒定耐藥突變位點(diǎn):在得到pol區(qū)序列的27個(gè)毒株中有16個(gè)出現(xiàn)耐藥突變位點(diǎn),其中7個(gè)可能會(huì)出現(xiàn)中高度耐藥,而其中2個(gè)未經(jīng)治療。(6)以30株hiv-1流行毒株作為樣本盤對(duì)2種常用檢測(cè)試劑進(jìn)行評(píng)估:以30株病毒的培養(yǎng)上清液對(duì)nuclisenseasyqhiv-1version2.0和cobasampliprep/cobastaqmanhiv-1testversion2.0這2種病毒載量試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)2種試劑盒對(duì)b亞型毒株的檢測(cè)具有良好的一致性,而對(duì)crf01_ae毒株檢測(cè)的一致性相對(duì)較差,提示現(xiàn)有的試劑檢測(cè)crf01_ae毒株的病毒載量還有待改進(jìn)。另外還評(píng)價(jià)了2種hiv-1p24抗原檢測(cè)試劑。結(jié)論:獲得了高濃度并大量?jī)龃姹７N且人口學(xué)和生物學(xué)背景清晰的30株我國(guó)hiv-1流行毒株,具有充分的基因型和表型多樣性。發(fā)現(xiàn)一株復(fù)制能力極強(qiáng)的crf01_ae亞型毒株,發(fā)現(xiàn)常用的病毒載量試劑檢測(cè)我國(guó)廣泛流行的crf01_ae毒株的一致性較差,提示需要針對(duì)crf01_ae毒株改善性能。這項(xiàng)研究為揭示我國(guó)hiv-1的致病機(jī)制及生物防治研究奠定了基礎(chǔ)。第二章hiv-1c類病毒rev蛋白第101位密碼子提前終止現(xiàn)象及其生物效應(yīng)研hiv-1的rev是病毒復(fù)制過程中的調(diào)節(jié)蛋白,通常由116個(gè)氨基酸組成,主要作用是特異性結(jié)合未剪輯及未剪輯完成的mrna上的rev蛋白反應(yīng)元件(revresponseelement,rre),幫助病毒mrna完成出核轉(zhuǎn)運(yùn)并進(jìn)行后續(xù)表達(dá)。rre是病毒mrna經(jīng)過多樣化剪輯后,未剪輯或未剪輯完成的mrna的內(nèi)含子上的一段rna,是rev蛋白結(jié)合mrna的靶標(biāo)。通過rev與rre的相互作用,使得mrna得以轉(zhuǎn)運(yùn)出核膜完成表達(dá)。以往的研究主要針對(duì)歐美常見b亞型毒株rev蛋白的第35~50位和第73~84位氨基酸的兩個(gè)主要功能域,未見對(duì)非b亞型rev蛋白及其c末端結(jié)構(gòu)和功能的研究。在對(duì)我國(guó)部分地區(qū)hiv-1rev基因進(jìn)行序列比對(duì)時(shí),我們發(fā)現(xiàn)在絕大多數(shù)c亞型和以c為骨架的重組病毒,rev蛋白的第108位氨基酸(hxb2:101位)出現(xiàn)了一個(gè)提前終止密碼子(prematureterminationcodon,ptc),這在其它亞型毒株中極少見到。目的:鑒定rev蛋白101位提前終止現(xiàn)象(rev101ptc)是否為hiv-1c類病毒所特有。分析其對(duì)rev-rre功能活性、病毒復(fù)制能力以及病毒進(jìn)化和傳播的可能影響。方法與結(jié)果:(1)比較rev101ptc在hiv各類毒株中出現(xiàn)的頻率以確定其是否為c類病毒的特征:從losalamoshivdatabase下載了hiv-1各亞型共3041條可用的rev基因序列,逐條比對(duì)校正并翻譯,發(fā)現(xiàn)rev101ptc在hiv-1c類病毒(c亞型和以c為骨架的重組病毒)中出現(xiàn)頻率為93.8%,而在其它亞型中出現(xiàn)的頻率為0.9%(p0.001),證明rev101提前終止現(xiàn)象為c類病毒所特有。(2)驗(yàn)證rev101ptc對(duì)病毒復(fù)制能力的影響:1)將b亞型感染性克隆pnl4-3上rev第101位密碼子caa(非終止)突變?yōu)閠aa(終止),轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞并包裝出病毒,發(fā)現(xiàn)rev101ptc的引入導(dǎo)致b亞型nl4-3毒株的復(fù)制能力的大幅下降(約2~4個(gè)log值)。2)以crf07_bc為c類病毒的代表,將其感染性克隆pxjdc6291-13上rev第101位密碼子taa(終止)突變?yōu)閏aa(非終止),將突變前后質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293t細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)突變前后病毒的p24抗原(gag-pol編碼)表達(dá)水平無差異。3)對(duì)編碼rev蛋白的mrna進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),分析rev101ptc對(duì)B和crf07_bc兩個(gè)毒株revmrna二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。發(fā)現(xiàn)rev101ptc的引入造成b亞型revmrna的“莖環(huán)”易位,顯著改變其二級(jí)結(jié)構(gòu);而rev101ptc存在與否對(duì)crf07_bcrevmrna的二級(jí)結(jié)構(gòu)并無影響,只是“莖狀”結(jié)構(gòu)上一個(gè)gu配對(duì)變?yōu)間c配對(duì)。4)為了驗(yàn)證rev101ptc的引入是否會(huì)影響rev蛋白的表達(dá)水平,將2種亞型rev101密碼子突變前后的表達(dá)質(zhì)粒等量轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞,通過westernblot檢測(cè)rev蛋白表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)revbrevbmut(101ptc),而rev07bc(101ptc)≈rev07bcmut,說明rev101ptc對(duì)b亞型rev蛋白的表達(dá)有影響,而對(duì)crf07_bc的rev蛋白的影響不明顯。(3)構(gòu)建gagpol-rre報(bào)告基因表達(dá)體系并驗(yàn)證rev101ptc和不同基因型的rre對(duì)rev-rre復(fù)合體功能的影響:構(gòu)建b和crf07_bc毒株有和沒有101ptc的4個(gè)rev表達(dá)質(zhì)粒(pcdna3.1(+)-rev-b、pcdna3.1(+)-rev-bmut(101ptc)、pcdna3.1(+)-rev-07bc(101ptc)和pcdna3.1(+)-07bcmut);構(gòu)建b和crf07_bc毒株的rre連接gag-pol基因的2個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒(pcdna3.1(+)-gagpol-rre_b和pcdna3.1(+)-gagpol-rre_07bc)。將2個(gè)報(bào)告基因質(zhì)粒分別與4個(gè)rev表達(dá)質(zhì)粒配對(duì),組成8個(gè)反應(yīng)體系。用不同濃度梯度的rev表達(dá)質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,外源rev蛋白就結(jié)合報(bào)告基因質(zhì)粒上的rre,幫助與之相連的gag-pol基因完成出核表達(dá),檢測(cè)培養(yǎng)上清液中g(shù)ag-pol的表達(dá)產(chǎn)物(p24抗原),繪制p24含量隨rev表達(dá)質(zhì)粒濃度變化的曲線,以曲線上升段線性擬合的斜率為指標(biāo)衡量rev-rre的相對(duì)活性。對(duì)得到的8組數(shù)據(jù)分別從rev和rre的角度進(jìn)行比較分析:1)rev101ptc對(duì)rev-rre活性的影響:只有在rev和rre均為b亞型時(shí),rev101ptc才使rev-rre的功能活性顯著下降(p=0.0017),其他組合rev-rre的功能活性均無顯著變化;而不論是否有rev101ptc,使用b亞型rre組合的rev-rre功能活性均顯著高于使用crf07_bc亞型rre的組合,提示rre的亞型特征對(duì)于rev-rre功能活性的影響比rev更大。2)rre亞型特征對(duì)于rev-rre活性的影響:只在與crf07_bc的野生型rev(含rev101ptc)結(jié)合時(shí),2種rre對(duì)rev-rre活性的影響才無顯著性差異(p=0.074)。而與不含rev101ptc的rev07bcmut結(jié)合時(shí),2種亞型RRE所造成的差異變得具有顯著性(P=0.017)。與突變前后的RevB結(jié)合時(shí),2種亞型RRE所造成的差異更大(P值分別為0.001和0.006)。(4)探究RRE上亞型特異性位點(diǎn)對(duì)Rev-RRE活性的影響:在2種亞型的RRE上選擇處于Rev結(jié)合位點(diǎn)或影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)的4組關(guān)鍵位點(diǎn)及突變,分別引入2種亞型的GagPolRRE報(bào)告基因,構(gòu)建8個(gè)質(zhì)粒,將突變前后的RRE分別與相應(yīng)的Rev結(jié)合,檢測(cè)其對(duì)Rev-RRE功能活性的影響。結(jié)果顯示,對(duì)于RRE B,T192A和G262AG264A突變導(dǎo)致Rev B-RRE B的功能活性顯著降低(T192A:P=0.0005;G262AG264A:P0.0001)。對(duì)于RRE 07BC,A111G-G120A和A262G-A264G導(dǎo)致Rev07-RRE07活性降低顯著影響(P值分別為0.0171和0.0019),而A192T則使其活性升高(P=0.0024)。提示192位堿基的改變對(duì)RRE功能的影響與兩個(gè)亞型RRE本來的活性趨勢(shì)一致;262-264位點(diǎn)的堿基在兩個(gè)亞型間的正反向突變均會(huì)造成Rev-RRE活性的顯著下降。結(jié)論:發(fā)現(xiàn)并證實(shí)Rev101提前終止密碼是HIV-1 C類病毒特有的現(xiàn)象。它在B亞型Rev編碼基因中的引入會(huì)顯著降低B亞型病毒的復(fù)制能力,這可能是通過打亂原有mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)影響Rev蛋白自身表達(dá)量來減少其它病毒蛋白的表達(dá)而造成的。但它的存在與否對(duì)HIV-1C類病毒的復(fù)制并無影響,這可能與其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)并不會(huì)因Rev101PTC而受到影響有關(guān)。C類病毒Rev蛋白可以兼容B亞型和C亞型的RRE,這可能是C類病毒Rev蛋白編碼基因在所有已發(fā)現(xiàn)的B/C重組毒株中得以保留的原因,與C類病毒維持適應(yīng)和傳播優(yōu)勢(shì)有關(guān)。Rev101提前終止密碼可能有助于C亞型Rev維持其自身的穩(wěn)定性或兼容性。兩個(gè)亞型毒株RRE上第192位使用堿基的差異可能是造成兩個(gè)亞型Rev-RRE的功能活性差異的原因之一;而兩個(gè)亞型RRE上第262位和264位核苷酸對(duì)于維持Rev-RRE功能活性至關(guān)重要。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R373

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6 姜北宇;章振華;李林;景小冬;張建偉;鄭小蘭;;禽流感H9亞型流行毒株交叉免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)觀察[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第七屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

7 張建偉;景小冬;章振華;李林;沈佳;鄭小蘭;姜北宇;;H9亞型禽流感病毒流行毒株交叉免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

8 張德明;魏宏;王隆柏;周倫江;莊向生;陳少鶯;劉玉濤;;豬流感福建流行毒株的分離、初步鑒定及潛在的公共衛(wèi)生學(xué)意義[A];人畜共患傳染病防治研究新成果匯編[C];2004年

9 徐雪;王川慶;王澤霖;楊霞;陳陸;王宏魁;劉春生;劉慧敏;鄭鹿平;郭倫濤;王新娟;;河南不同臨床型雞支氣管炎病毒流行毒株的分離鑒定及其S1基因變異分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十五次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

10 林健;劉月煥;韓春華;馬明;劉永宏;潘潔;;雞新城疫弱毒疫苗對(duì)近年流行毒株保護(hù)作用的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十四次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 陳滟;廣東兩科研項(xiàng)目填補(bǔ)國(guó)內(nèi)空白[N];國(guó)際商報(bào);2007年

2 邵斌 實(shí)習(xí)記者 郝東方;我國(guó)畜禽四種主要病毒研究取得重要進(jìn)展[N];大眾科技報(bào);2003年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前9條

1 張艷萍;我國(guó)雞馬立克氏病毒流行毒株生物學(xué)特性分析[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 韓婧婉;我國(guó)HIV-1流行毒株的分離鑒定及Rev蛋白第101位提前終止的生物效應(yīng)研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2016年

3 陳德勝;傳染性支氣管炎病毒中國(guó)地方流行毒株的分子流行病學(xué)研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2000年

4 朱妍;中國(guó)豬瘟病毒流行毒株遺傳多樣性及抗原性研究[D];吉林大學(xué);2008年

5 耿慶華;我國(guó)馬傳染性貧血弱毒疫苗株與美洲流行毒株鑒別診斷方法的建立及標(biāo)記疫苗的研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2006年

6 陳寧;攜帶流行毒株E2基因的重組豬瘟病毒C株的拯救與鑒定[D];浙江大學(xué);2009年

7 溫貴蘭;豬繁殖與呼吸綜合征病毒抑制IFN-β表達(dá)機(jī)制的探索[D];浙江大學(xué);2013年

8 王興龍;豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行毒株NSP2基因遺傳變異及GM-CSF對(duì)GP3/GP5的免疫增強(qiáng)作用研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2010年

9 吳庭才;豫西地區(qū)IBD流行毒株不同佐劑滅活苗的研制及應(yīng)用[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 謝曉明;豬瘟病毒2.1基因亞型野毒株的體外細(xì)胞傳代適應(yīng)與全基因組序列分析[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

2 孔衍琳;廣西三城市HIV-1型流行毒株gag基因亞型分析[D];桂林醫(yī)學(xué)院;2015年

3 鄭逢梅;豬流行性腹瀉流行毒株部分基因分子特征及防治措施研究[D];河南農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

4 官丁明;IBDV地方流行毒株的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[D];廣西民族大學(xué);2010年

5 黃耀華;豬瘟病毒分子流行病學(xué)研究及流行毒株全基因組序列分析[D];海南大學(xué);2015年

6 鄭敏;豬圓環(huán)病毒Ⅱ型流行毒株全基因組序列分析[D];福建農(nóng)林大學(xué);2008年

7 姚亞萍;浙江省2004-2011年HIV-1流行毒株的傳播和進(jìn)化研究[D];浙江大學(xué);2013年

8 扈鴻霞;華東地區(qū)豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5基因特征及流行毒株的分離鑒定[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 林昌華;廣西HP-PRRSV流行毒株遺傳進(jìn)化研究[D];廣西大學(xué);2013年

10 張曉楠;幾株IBV弱毒對(duì)流行毒株CK/CH/LDL/97I的免疫保護(hù)作用評(píng)價(jià)[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

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本文編號(hào)：2506242