【摘要】：RNA聚合酶(RNAP)在遺傳信息的表達(dá)過(guò)程當(dāng)中起至關(guān)重要的作用:在DNA鏈上移動(dòng)并將包含遺傳信息的DNA鏈轉(zhuǎn)錄為RNA鏈。RNA聚合酶包含單體和多體兩種。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,最重要的兩個(gè)步驟是:RNAP沿DNA鏈的移位(translocation)和RNAP對(duì)底物核糖核苷酸的選擇(selection)。RNAP一次可以轉(zhuǎn)錄上百到上千個(gè)核苷酸,在這個(gè)持續(xù)過(guò)程中RNAP的機(jī)械移動(dòng)機(jī)制一直是研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。遺傳信息的保真度對(duì)生命體而言至關(guān)重要,在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中與保真度相關(guān)的就是RNAP對(duì)底物核苷酸的選擇機(jī)制。近幾十年的研究已經(jīng)對(duì)RNAP的工作機(jī)制提供了很多信息,但仍然有很多地方還不清楚。分子動(dòng)力學(xué)(Molecular Dynamics,MD)模擬作為實(shí)驗(yàn)的重要補(bǔ)充在近些年的研究中扮演了不可替代的角色。本文利用分子動(dòng)力學(xué)模擬的方法對(duì)RNA聚合酶的移位機(jī)制和選擇機(jī)制進(jìn)行了研究,為其工作機(jī)制的研究提供了重要的信息。全文主要包括以下幾個(gè)部分:多體RNA聚合酶Pol II的移位機(jī)制研究。通過(guò)和細(xì)菌內(nèi)的多體RNAP結(jié)構(gòu)的對(duì)比,一個(gè)螺旋(Bridge Helix,BH)的flipped-out構(gòu)象和straight構(gòu)象之間的轉(zhuǎn)變被賦予了重要的意義。然而,結(jié)晶結(jié)構(gòu)并未在Pol II中發(fā)現(xiàn)BH的flipped-out構(gòu)象。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)的模擬,我們發(fā)現(xiàn)了2個(gè)BH的flipped-out構(gòu)象,這兩個(gè)構(gòu)象對(duì)RNAP的移位過(guò)程均有促進(jìn)作用,而且其中一個(gè)結(jié)構(gòu)與結(jié)晶結(jié)構(gòu)在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的BH的flipped-out構(gòu)象非常類似,證明了BH的flipped-out構(gòu)象在Pol II中的存在。單體T7 RNA聚合酶的移位機(jī)制研究。T7 RNAP作為研究單體RNAP的模型,關(guān)于其移位機(jī)理主要有:Power-Stroke模型和布朗棘輪(Brownian-Ratchet)模型。我們分子動(dòng)力學(xué)模擬的結(jié)果表明:T7 RNAP的移位機(jī)理為布朗棘輪模型。我們進(jìn)一步解釋了實(shí)驗(yàn)中移位前后的能量差的來(lái)源。計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)結(jié)果定量吻合。單體T7 RNA聚合酶的選擇機(jī)制研究。我們通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn),在T7 RNAP移位過(guò)程中存在一個(gè)中間態(tài)。在這個(gè)中間態(tài)中,將要作為模板配對(duì)的過(guò)渡DNA核苷酸(TN)能夠移位到活性位點(diǎn),參與對(duì)底物NTP的選擇。這個(gè)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有相應(yīng)的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。我們利用分子動(dòng)力學(xué)模擬對(duì)這個(gè)狀態(tài)時(shí)NTP的選擇機(jī)制進(jìn)行了研究。我們發(fā)現(xiàn),NTP的選擇可以依靠NTP與DNA模板堿基之間的WC(Watson-Crick)相互作用,活性位點(diǎn)附近的穩(wěn)定性和Y639殘基。這可能揭示了傳統(tǒng)選擇路徑之外的另一條選擇路徑。
[Abstract]:RNA polymerase (RNAP) plays an important role in the expression of genetic information: it moves through the DNA chain and transcribes the DNA chain containing genetic information into the RNA chain. RNA polymerase contains two kinds of monomers and polysomes. Two of the most important steps in the transcription process are the transfer of RNAP along the DNA strand (translocation) and RNAP's choice of substrate ribonucleotides (selection). RNAP can transcribe hundreds to thousands of nucleotides at a time. In this continuous process, the mechanism of mechanical movement of RNAP has always been the focus and focus of research. The fidelity of genetic information is very important to the whole life. In the process of transcription, the selection mechanism of substrate nucleotides by RNAP is related to fidelity. The research of recent decades has provided a lot of information about the working mechanism of RNAP, but there are still many things that are not clear. Molecular dynamics (Molecular Dynamics,MD) simulation plays an irreplaceable role in recent studies as an important complement to experiments. In this paper, the molecular dynamics simulation method was used to study the mechanism of RNA polymerase translocation and selection, which provided important information for the study of its working mechanism. The main contents of this paper are as follows: studies on the translocation mechanism of multi-body RNA polymerase Pol II. By comparing with the multi-body RNAP structure in bacteria, the transition between the flipped-out conformation and the straight conformation of a Bridge Helix,BH is of great significance. However, the flipped-out conformation of BH was not found in Pol II. By molecular dynamics simulation, we found two flipped-out conformations of BH, both of which promote the translocation of RNAP, and one of them is very similar to the flipped-out conformation of BH found in bacteria with crystalline structure. The existence of flipped-out conformation of BH in Pol II was proved. The translocation mechanism of monomer T7 RNA polymerase was studied. As a model for studying monomer RNAP, T7 RNAP was used as the model of monomeric RNAP. The shift mechanism of T7 PCR was mainly Power-Stroke model and Brownian ratchet (Brownian-Ratchet) model. The results of our molecular dynamics simulation show that the shift mechanism of T 7 RNAP is Brownian ratchet model. We further explain the source of the energy difference before and after the shift in the experiment. The calculated results are in good agreement with the experimental results. Selection mechanism of monomer T7 RNA polymerase. We found that there is an intermediate state in the process of T7 RNAP shift by molecular dynamics simulation. In this intermediate state, the transition DNA nucleotide (TN), which will be paired as a template, can be transferred to the active site to participate in the selection of substrate NTP. This structure has no corresponding crystalline structure. We use molecular dynamics simulation to study the selection mechanism of NTP in this state. We found that the selection of NTP can rely on the WC (Watson-Crick) interaction between NTP and DNA template bases, the stability near the active site and the Y639 residue. This may reveal another alternative to the traditional selection path.
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)(中國(guó)科學(xué)院物理研究所)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q75

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本文編號(hào)：2457170