【摘要】：活的但非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)是微生物應(yīng)對(duì)各種環(huán)境壓力的一種生存機(jī)制。藤黃球菌等微生物的復(fù)蘇促進(jìn)因子(resuscitation-promoting factor,Rpf)可將 VBNC 狀態(tài)菌復(fù)蘇。目前關(guān)于 VBNC菌及其復(fù)蘇研究主要集中在病原菌及流行病學(xué)領(lǐng)域。有機(jī)異生質(zhì)污染土壤、底泥等環(huán)境中大量微生物受脅迫處于VBNC狀態(tài),對(duì)其進(jìn)行復(fù)蘇研究,有望提高有機(jī)污染物微生物降解修復(fù)能力,獲得高效降解新種資源,并有助于揭示微生物VBNC誘導(dǎo)及其復(fù)蘇機(jī)理。本研究通過(guò)響應(yīng)面分析法(response surface methodology,RSM)優(yōu)化藤黃球菌含Rpf胞外分泌物(extracellular organic matter,EOM)的蛋白產(chǎn)量;以多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls,PCBs)污染土壤或底泥為富集源,研究藤黃球菌EOM對(duì)富集培養(yǎng)體中菌體生長(zhǎng)、聯(lián)苯降解性能、菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的影響;同時(shí)分離培養(yǎng)、鑒定EOM添加組特有的菌株,選擇聯(lián)苯(biphenyl,BP)/PCBs降解性能最高的菌株進(jìn)行多相分類鑒定,確定其新種分類地位;并通過(guò)低溫和貧營(yíng)養(yǎng)誘導(dǎo)新種菌株進(jìn)入VBNC狀態(tài),研究其形態(tài)、酶活性及基因轉(zhuǎn)錄水平方面的變化,以期揭示VBNC狀態(tài)的形成機(jī)理。研究主要結(jié)果如下:(1)采用PBD(Plackett-Burman Design)設(shè)計(jì)法以蛋白產(chǎn)量為響應(yīng)指標(biāo),從培養(yǎng)基成分與培養(yǎng)條件中篩選出4個(gè)顯著因素。然后采用中心組合設(shè)計(jì)(central composite design,CCD)響應(yīng)面分析法獲得藤黃球菌EOM產(chǎn)蛋白的優(yōu)化條件:礦物鹽溶液1.5ml/L、L-乳酸鋰鹽8.75g/L、pH=7.5、培養(yǎng)時(shí)間48h。EOM主成分分析表明,EOM既含有多糖又含有蛋白質(zhì),分別為405.74和25.13 mg/L。由凝膠色譜層析結(jié)果可知,多糖主要是分子量為4422 Da的低聚糖,主要蛋白質(zhì)分子量為11489 Da和9562 Da�？寺”磉_(dá)所得的Rpf重組蛋白分子量為45 KDa,是理論值的1.25倍。(2)PCBs污染土壤或底泥來(lái)源的添加EOM的富集培養(yǎng)體,其耐受BP濃度和BP降解效率及菌群多樣性有明顯提高,菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生明顯變化。對(duì)比EOM添加組和滅活EOM添加組可知,EOM中的蛋白質(zhì)起到關(guān)鍵作用。結(jié)合聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)和16S rRNA基因高通量測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn),EOM顯著促進(jìn)放線菌門(Actinobacteria)的紅球菌屬(Rhodococcus)和變形菌門(Proteobacteria)的假單胞菌屬(Pseudomonas)的菌群生長(zhǎng)。同時(shí),在被試的三組不同PCBs污染底泥樣中,EOM對(duì)PCBs濃度最高的SS3底泥樣影響最大,且Actinobacteria門的Rhodococcus屬及其它的未可培養(yǎng)菌群可能是其中被復(fù)蘇的高效降解菌群。從處理組分離的特有菌株歸屬于9個(gè)菌屬,大部分為Actinobacteria。其中Rhodococcus屬菌株TG9具有最強(qiáng)的BP/PCBs降解性能,其耐受BP濃度可達(dá)3000mg/L,菌株TG13次之,且兩者均可以降解BP開環(huán)代謝產(chǎn)物苯甲酸。(3)選擇BP/PCBs降解性能最強(qiáng)的菌株TG9T進(jìn)行多相分類鑒定。結(jié)果表明,除4個(gè)模式菌株(Rhodococcus gordoniae DSM 44689T、Rhodococcus pyridinivorans DSM 44555T、Rhodococcus rhodochrous DSM 43241T和Rhodococcus artemisiae DSM 45380T)外,菌株TG9T與其它菌株16S rRNA基因序列相似性均低于98%。且菌株TG9T與4個(gè)模式菌株在生長(zhǎng)溫度范圍、pH范圍、鹽濃度范圍、碳源利用、氮源利用、產(chǎn)酸底物、底物水解和抗生素敏感等表型特征上存在差異。同時(shí),它具有以下化學(xué)分類特征:屬于典型的細(xì)胞壁Ⅳ型細(xì)菌,脂肪酸主要組分為C16:0,細(xì)胞極性脂組分包括磷脂、糖脂和未確定極性脂,甲基萘醌MK-8(H2)是唯一的醌組分,且細(xì)胞中存在枝菌酸甲基脂組分。另外,它的G+C含量為62.8 mol%,且與4個(gè)模式菌株DNA-DNA同源性均低于50%�；诰闠G9T的表型、化學(xué)分類及基因型特征分析可知,它與4個(gè)模式菌株存在差異,因此,確定菌株TG9T的新種分類地位,命名為Rhodococcus biphenylivorans(嗜聯(lián)苯紅球菌)。(4)將菌株R.biphenylivorans TG9T在低溫和貧營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)。結(jié)果表明,145d后其可培養(yǎng)數(shù)降低至0.1 CFU/mL,即進(jìn)入VBNC狀態(tài)。將VBNC狀態(tài)菌懸液涂布于LB(Luria-Bertani)固體培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)3d后即恢復(fù)可培養(yǎng)狀態(tài)。由形態(tài)及酶活分析可知,VBNC細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮,明顯小于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,且熒光強(qiáng)度也明顯減弱。復(fù)蘇細(xì)胞的大小和熒光強(qiáng)度均介于VBNC細(xì)胞和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞之間。同時(shí),三種細(xì)胞均具有API ZYM試劑盒19種酶中的8種酶活性,而在VBNC細(xì)胞中的活性低于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明,VBNC細(xì)胞與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞相比共有2097個(gè)差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),上調(diào)和下調(diào)基因分別為1452和645個(gè),雖然上調(diào)基因要多于下調(diào)基因,但是差異倍數(shù)在20倍以上的上調(diào)和下調(diào)基因分別為17和42個(gè)。綜合GO(Gene Ontology)功能和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝途徑富集分析可知,進(jìn)入VBNC狀態(tài)后,其上調(diào)基因主要涉及ATP積累(ATP accumulation)、蛋白修飾(protein modification)、肽聚糖合成(peptidoglycan biosynthesis)和RNA聚合酶(RNA polymerase)。下調(diào)基因主要與氧化還原過(guò)程(oxidation-reduction process)和氨基酸代謝(amino acid metabolism)相關(guān)。綜上所述,本論文研究結(jié)果為探索新的異生質(zhì)高效降解菌資源開辟了新的途徑,為開發(fā)基于VBNC菌復(fù)蘇從而促進(jìn)土壤有機(jī)污染微生物修復(fù)的新技術(shù)奠定了理論基礎(chǔ),并為揭示異生質(zhì)降解菌株的VBNC狀態(tài)誘導(dǎo)-復(fù)蘇機(jī)理進(jìn)行了有益的探索。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：X172
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本文編號(hào)：2386770