【摘要】：哺乳動物大腦皮層六層結構的形成依賴神經元的正確遷移,該過程受到多種信號分子的調節(jié),神經元遷移障礙會造成多種神經系統疾病。Fyn是一種非受體酪氨酸激酶,Fyn敲除小鼠大腦皮質結構異常,大腦皮質淺層神經元數量減少,晚出生神經元異常定位在大腦皮質深層。Fyn在神經元遷移中發(fā)揮重要的調控作用,但其分子機制尚不清楚。為了研究Fyn對神經元遷移的影響及其分子機制,我們結合本實驗室的前期研究結果,對Fyn在神經元遷移中的作用及其調控進行進一步探索。為了研究Fyn對神經元遷移的影響及其分子機制,利用子宮內電擊轉染技術,并結合RNA干擾和基因定點突變探討了降低Fyn表達和N末端修飾位點突變對神經元遷移和神經元形態(tài)的影響。通過Western blot和免疫熒光染色檢測Fyn下游可能的信號分子,構建這些分子的不同點突變載體,分別將其與Fyn超表達和干擾載體共同轉染神經元,探索Fyn調節(jié)神經元遷移的信號通路。研究結果如下:1.在之前的研究中我們已經篩選出有效的干擾片段,結合子宮內電擊轉染發(fā)現降低Fyn表達不僅對晚出生的神經元遷移有影響,還抑制早出生神經元的遷移。在胚胎15.5天轉染標記晚出生的神經元,出生后1天取材,對照組中大部分神經元已經到達它們的目的地——邊緣帶附近,干擾組中大部分被轉染的神經元則滯留在中間帶。并且,在出生后第7天,干擾組中許多神經元仍停留在中間帶和皮質板,說明干擾Fyn抑制神經元遷移而不是延遲遷移。在胚胎12.5天轉染標記早出生神經元,胚胎16.5天取材時對照組中神經元遷移進入皮質板,干擾組大部分神經元則滯留在中間帶。降低Fyn表達在遷移初期阻礙神經元頂突起的形成,在中間帶和皮質板交界處雙極神經元比例降低,神經元多數呈圓形且沒有形成明顯的頂突起;進入皮質板的神經元頂突起增長,但存在一些極性反轉的細胞;而接觸到邊緣帶的細胞則頂突起長度增加且分枝減少。2.Fyn的N末端修飾包括第二位甘氨酸豆蔻�；揎�、第三和第六位半胱氨酸棕櫚�；揎椧约暗谄吆偷诰盼患谆揎�,N末端修飾對Fyn的功能具有重要調節(jié)作用。利用基因定點突變構建4種Fyn的N末端點突變真核表達載體:Fyn-G2A、Fyn-C3,6S、Fyn-K7A和Fyn-K7,9A。子宮內電擊轉染結果顯示在胚胎15.5天轉染后5天,Fyn-WT超表達抑制神經元遷移,神經元在腦室區(qū)和中間帶形成團狀聚集,幾乎沒有到達邊緣帶附近的神經元。各點突變載體轉染組中,大多數神經元能夠接觸到邊緣帶,這與對照組相似但與Fyn-WT轉染組相比有顯著差異。Fyn-K7A,Fyn-K7,9A轉染組中細胞聚集減少,在Fyn-G2A,Fyn-C3,6S轉染組中沒有神經元聚集現象。Fyn-G2A轉染組中出現一些頂突起朝向腦室區(qū)的細胞,產生了類似干擾Fyn所引起的神經元極性反轉。以上結果說明這些修飾位點在Fyn調節(jié)神經元遷移的過程中有重要作用。3.Western blot和免疫熒光染色發(fā)現Fyn引起FAK-Y925和PI3K-p85磷酸化,研究顯示Rho蛋白GTP酶對神經元遷移有重要的調節(jié)作用。通過構建FAK-Y925F(不可被磷酸化),RhoA-DN,RhoA-CA,Rac1-DN,Rac1-CA,結合子宮內電擊轉染探索Fyn可能的信號通路。結果顯示在胚胎15.5天轉染后5天,FAK-Y925F+Fyn-WT轉染組多數神經元到達邊緣帶附近,細胞聚集明顯減少,說明FAK-Y925F能夠挽救Fyn-WT造成的神經元遷移障礙和細胞異常聚集。Fyn-WT+Rac1-DN和shFyn+Rac1-CA轉染組神經元在各層的分布與對照組和Fyn-WT組相比均有顯著差異,神經元聚集減少,但仍有大量細胞形成團狀或柱狀聚集,說明Rac1參與Fyn對神經元遷移的調節(jié),但只能在一定程度上挽救Fyn所引起神經元遷移障礙。Fyn-WT+RhoA-DN和shFyn+RhoA-CA轉染組神經元在不同層的分布與對照組相似,Fyn-WT+RhoA-DN轉染組形成聚集的神經元明顯減少,shFyn+RhoA-CA轉染組大部分神經元在中間帶和皮質板交界處可以形成典型的雙極形態(tài),且皮質板中部分神經元頂突起恢復正常,但是到達邊緣帶的神經元仍然有較長的頂突起和較少的分枝,說明RhoA可能是Fyn調節(jié)神經元遷移的關鍵分子。綜上所述,Fyn對早出生和晚出生的神經元遷移都有重要的調控作用,并對神經元形態(tài)造成影響,通過調節(jié)神經元形態(tài)變化影響神經元遷移。Fyn蛋白表達缺陷導致神經元頂突起形態(tài)異常,FAK和RhoA可能是Fyn調節(jié)神經元遷移的關鍵分子,Rac1也參與Fyn對神經元遷移的調控。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：西北農林科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q42

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本文編號：2318059