【摘要】：益生菌能夠維持和改善腸道微生物的平衡并且對宿主具有多種有益影響,為了能夠發(fā)揮其功能,益生菌要能夠耐受胃腸道的“惡劣環(huán)境”,并能夠定植在腸道中。益生菌的益生性具有菌株特異性,然而目前國內(nèi)益生菌制劑僅有菌種名稱,沒有菌株的具體功能特性信息和遺傳背景信息,更沒有菌株的全基因組信息。因此,本研究通過體外試驗(yàn)和比較基因組學(xué)分析相結(jié)合的方法,對糞腸球菌菌株的益生性和安全性進(jìn)行評價(jià),為益生菌制劑的開發(fā)奠定理論和應(yīng)用基礎(chǔ)。本文首先對分離自傳統(tǒng)乳制品中能顯著抑制致病菌的乳酸菌進(jìn)行了篩選和鑒定,隨后結(jié)合比較基因組學(xué)和藥物敏感性實(shí)驗(yàn)對糞腸球菌的潛在益生性和安全性進(jìn)行了關(guān)聯(lián)分析,最后基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝產(chǎn)物分析對糞腸球菌有氧呼吸條件下糖代謝途徑的研究結(jié)果優(yōu)化其增殖條件實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)。從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到116株乳酸菌,通過體外實(shí)驗(yàn)篩選得到4株產(chǎn)細(xì)菌素的乳酸菌菌株。隨后對這4株菌的酸耐受能力、膽鹽耐受能力和黏附能力進(jìn)行研究,最終確定Enterococcus faecalis LD33可做為潛在的益生菌應(yīng)用,并對其所產(chǎn)細(xì)菌素進(jìn)行了初步純化,利用Tricine-SDS-PAGE電泳確定其分子量約為10 KDa,且具有相對較好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。以E.faecalis LD33菌株為目的菌株,通過全基因組測序獲得其基因組完成圖。隨后比較基因組學(xué)分析表明,其染色體上不但具有同酸耐受性和膽鹽耐受性密切相關(guān)的ATPase、Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、膽鹽水解酶、環(huán)丙烷脂酰磷脂合成酶以及多個雙組分調(diào)控系統(tǒng)的編碼基因,而且還具有同黏附作用相關(guān)的黏附素蛋白、纖連蛋白、細(xì)胞表面蛋白、轉(zhuǎn)肽酶和延長因子結(jié)合蛋白編碼基因。此外,還具有一個由雙組分調(diào)控系統(tǒng)、ABC型抗菌肽轉(zhuǎn)運(yùn)通透酶和細(xì)菌素編碼基因構(gòu)成的細(xì)菌素合成基因簇。這些功能基因恰好能夠與體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果E.faecalis LD33的良好酸耐受、膽鹽耐受能力和黏附性以及對致病菌的抑制作用相互驗(yàn)證。比較基因組分析還發(fā)現(xiàn)E.faecalis LD33的染色體上無致病性毒力因子的編碼基因且不具備通過基因島、質(zhì)粒等可移動基因元件來傳播藥物抗性的基本條件,抗生素敏感性測試實(shí)驗(yàn)表明其僅對氨基糖苷類抗生素及利福平具有抗性,可以作為益生菌來安全使用。通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對發(fā)酵和有氧呼吸代謝條件下的E.faecalis LD33呼吸鏈和糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)差異進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)E.faecalis LD33呼吸鏈編碼基因?qū)儆诮M成型表達(dá),與其是否進(jìn)行有氧呼吸代謝無關(guān),結(jié)合代謝產(chǎn)物分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)其進(jìn)行有氧呼吸代謝時(shí),其通過增加丙酮酸代謝通路和丁酸代謝通路中g(shù)ap、pdh、eut D、ack A、als S和but A基因的表達(dá)量,降低ldh基因的表達(dá)量來改變葡萄糖的代謝途徑,使碳水化合物代謝的主要終產(chǎn)物由乳酸變成乳酸、乙酸和乙偶姻,當(dāng)葡萄糖被耗盡之后它能夠通過代謝其他碳水化合物和氨基酸來繼續(xù)增殖,從而獲得更高的生物量和極強(qiáng)的長期存活率�；谝陨限D(zhuǎn)錄組和代謝產(chǎn)物分析結(jié)果對E.faecalis LD33高密度培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化,優(yōu)化后E.faecalis LD33培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)可以達(dá)到6.37×109 CFU/m L。長期保存實(shí)驗(yàn)表明,在4℃保藏5 d后在發(fā)酵條件下培養(yǎng)的E.faecalis LD33活菌數(shù)已經(jīng)下降到106 CFU/m L,在第30 d已經(jīng)很難檢測到了,而在呼吸條件下經(jīng)過45 d的保存,活菌數(shù)仍然維持在10~8 CFU/m L左右。
[Abstract]:Probiotics can maintain and improve the balance of intestinal microorganisms and have a variety of beneficial effects on the host, in order to be able to function, probiotic bacteria can withstand the 鈥渉arsh environment鈥，

本文編號：2304806