【摘要】：禽流感病毒作為一種重要的人畜共患病病原,不僅能感染禽類,還時常感染哺乳動物,直接或間接導(dǎo)致流感在人類的散發(fā)或大流行。禽流感病毒共有16個HA亞型以及9個NA亞型,正常情況下禽流感病毒由于對人唾液酸受體較低的親和性使得其不能直接感染人。但抗原的突變及基因片段的重組使得流感病毒能夠快速的進化,嚴重威脅著畜禽養(yǎng)殖業(yè)及人類的公共衛(wèi)生安全。繼2013年我國東部地區(qū)首次出現(xiàn)人感染H7N9禽流感病毒的疫情后,同年12月,江西省又報道了首例人感染H10N8禽流感病毒的事件,患者于住院后9天死亡。目前感染H10N8流感病毒共3人,其中死亡2人。關(guān)于H10N8流感病毒的研究表明其受體結(jié)合嗜性更偏好禽類受體。但關(guān)于此毒株的其他信息尚不明確,有待進一步探索。本研究選取H10N8疫情發(fā)生同時期分離的兩株H10N8毒株,一株毒株為人源A/Jiangxi-Donghu/346-1/2013(H10N8),簡稱JX346,另一株為禽源A/Chicken/Jiangxi/102/2013(H10N8),簡稱JX102。對它們生物學(xué)特性的研究表明:人源毒株JX346相對于禽源毒株JX102,在體外哺乳動物源的MDCK、HEK293T以及禽源DF-1細胞上表現(xiàn)出更強的增殖能力。JX102對小鼠無明顯致病力,MLD50106EID50,而JX346表現(xiàn)出更強的致病力(MLD50=102.25EID50),106EID50的攻毒劑量,攻毒后小鼠在5d內(nèi)全部死亡,且小鼠腦內(nèi)也能檢測到病毒。利用流感病毒的反向操作技術(shù),分別以兩株病毒為骨架,對內(nèi)部基因片段進行單一替換。重組病毒的小鼠試驗結(jié)果顯示,當JX102替換了JX346毒株的PB2片段后,即重組病毒JX102-JX346 PB2,對小鼠表現(xiàn)強致病力,106EID50的劑量攻毒后5d小鼠全部死亡。同樣的,JX346替換了JX102毒株的PB2片段后,即重組病毒JX346-102PB2,對小鼠的毒力顯著減弱,肺組織臟器滴度明顯下降,攻毒后小鼠未出現(xiàn)死亡,且體重持續(xù)上升,且其他基因的替換無明顯影響。這一結(jié)果表明,PB2基因是H10N8禽流感病毒致病的關(guān)鍵因素。對兩株病毒PB2蛋白的氨基酸序列比對分析共發(fā)現(xiàn)11個氨基酸位點的差異,其中的627E/K為常見的禽流感病毒適應(yīng)哺乳動物的關(guān)鍵位點。利用單點突變技術(shù)發(fā)現(xiàn),627K是JX346致病力的關(guān)鍵但不是唯一因素,JX346-PB2 627E仍對小鼠表現(xiàn)出較強毒力(MLD50=103.5EID50)。以JX346-PB2 627E為骨架,對其他差異位點進行突變,最后結(jié)果發(fā)現(xiàn)87e、292v、340k、588v、648v及676m等位點與jx346毒株的強致病性相關(guān)。位于pb2627區(qū)域(domain)的588v的突變使得jx346-pb2627e病毒在哺乳動物細胞上的聚合酶活力降低了約80%。進一步的研究發(fā)現(xiàn)pb2a588v的單點突變增強了禽源h10n8毒株、h7n9毒株及h9n2毒株在哺乳動物細胞上的聚合酶活力及增殖能力以及增強了這些毒株對小鼠的致病性。對流感病毒數(shù)據(jù)庫中的流感pb2的序列分析發(fā)現(xiàn),pb2-588v毒株在h10n8、h7n9及h9n2毒株中的比例在2013年以后逐漸增多。以上結(jié)果表明,pb2蛋白的588位點可能是禽流感病毒適應(yīng)哺乳動物的另一種新的形式。在發(fā)現(xiàn)588位纈氨酸的重要作用后,我們對不同亞型禽流感病毒的pb2588位點進行了分析,發(fā)現(xiàn)不同亞型流感病毒的pb2588位點有著各自特異的氨基酸分布。為了弄清這些氨基酸對禽流感病毒適應(yīng)哺乳動物的影響以及588位點適應(yīng)哺乳動物的分子機制,我們以jx102為模型,將性質(zhì)相似的脂肪族氨基酸(t、i、l、s、g)引入jx102pb2蛋白的588位點,通過體內(nèi)體外的實驗研究這些氨基酸對病毒生物學(xué)特性的影響。結(jié)果顯示,588v、588t、588i及588l能明顯增強病毒在哺乳動物細胞上的聚合酶活力和增殖能力,而588s則無明顯作用,588g則有反作用。動物實驗結(jié)果表明,588v、588t、588i及588l毒株均對小鼠表現(xiàn)致死性,il-6、tnf-α、ip-10等炎性細胞因子在攻毒小鼠肺組織的mrna水平明顯高于親本毒(4-6倍),肺組織出現(xiàn)嚴重的炎性細胞滲出及出血等病理特征。對pb2588位點適應(yīng)哺乳動物的機制進行探索發(fā)現(xiàn)與sirna的陰性對照組相比,在a549細胞上沉默importin-α1后,588v、588t、588i及588l的聚合酶活力降低了約50%,且增殖能力也顯著減弱。而沉默其他核輸入蛋白,如importin-α3、α4、α5及α7則無減弱現(xiàn)象。以上結(jié)果表明,禽源h10n8流感病毒pb2蛋白588位點適應(yīng)哺乳動物可能受宿主蛋白importin-α1調(diào)控。綜上所述,本課題研究了新型h10n8禽流感病毒的生物學(xué)特性,發(fā)現(xiàn)人源毒株jx346對小鼠呈高致病力,并且這種強致病力與其pb2蛋白上的87e、292v、340k、588v、627k、648v及676m等位點有關(guān)。進一步的研究人源h10n8毒株上發(fā)現(xiàn)的pb2588位點的單點突變(a→v)能同時增強禽源h7n9、h9n2亞型禽流感病毒對哺乳動物的適應(yīng)性。而pb2588位點增強哺乳動物適應(yīng)性與宿主蛋白importin-α1密切相關(guān),這一發(fā)現(xiàn)為H10N8及H7N9、H9N2禽流感病毒的治療和預(yù)防提供了理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：2281483