【摘要】：目前,日益枯竭的石油資源導(dǎo)致了新型可再生能源產(chǎn)業(yè)的興起,現(xiàn)在以木質(zhì)纖維素生產(chǎn)生物乙醇越來越受到重視。第一代生物乙醇存在與人爭糧的問題,因此第二代生物乙醇技術(shù)應(yīng)運而生：利用秸稈、玉米芯等木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)生物乙醇。在木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為糖的過程中,纖維素酶具有重要的作用。目前工業(yè)生產(chǎn)中使用的纖維素酶的來源主要是絲狀真菌,如里氏木霉,草酸青霉等。但是在第二代生物乙醇的生產(chǎn)過程中,生產(chǎn)成本過高成為限制該行業(yè)發(fā)展的主要因素。影響該產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)成本過高主要有兩方面的原因：一方面的原因是纖維素酶的產(chǎn)量過低；二是纖維素酶的降解效率較低,為了達(dá)到較好的降解效果,需要添加纖維素酶的量增多。為了降低纖維素酶的生產(chǎn)成本,研究者進(jìn)行了多方面的努力。一是對纖維素酶的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究,二是纖維素酶進(jìn)行復(fù)配提高纖維素酶的轉(zhuǎn)化效率,降低纖維素酶的成本。目前,在工業(yè)生產(chǎn)中里氏木霉由于較高的纖維素酶產(chǎn)量,是一種重要的纖維素酶生產(chǎn)菌株。研究發(fā)現(xiàn),纖維素酶的調(diào)控是一個非常復(fù)雜的過程：該過程受到碳源、光照和pH等外面環(huán)境變化的影響。纖維素酶轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是受到纖維素酶轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控如：轉(zhuǎn)錄激活因子Xyr1、Ace2和Clr2；轉(zhuǎn)錄抑制因子Cre1和Acel。Cre1是纖維素酶主要的轉(zhuǎn)錄抑制因子,本實驗中對Cre1的功能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。同時,研究還發(fā)現(xiàn)一些未知的途徑參與到纖維素酶的調(diào)控,本實驗中我們研究發(fā)現(xiàn)了一類新型的纖維素酶調(diào)控家族-velvet家族蛋白是調(diào)控纖維素酶生產(chǎn)的重要因子。同時在本實驗中,我們對于利用纖維素酶降解工業(yè)廢棄物馬鈴薯渣轉(zhuǎn)化生產(chǎn)葡萄糖的工藝進(jìn)行了初步的探究。本論文中主要的實驗內(nèi)容包括以下3個方面：1)里氏木霉中velvet家族蛋白功能研究。在里氏木霉中,利用BLAST的方法,找到3個含有velvet結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì),系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)這三個蛋白分別屬于VeA, VelB和Ve1C家族,我們將其分別命名為Vel,Vel2和Ve13。利用同源重組的方法,將基因進(jìn)行敲除,分別獲得了Δvel,Δvel2和△vel3菌株,同時研究了在光照和黑暗條件下這三株突變菌株在菌落形態(tài)、無性孢子生成和纖維素酶生產(chǎn)的變化。將出發(fā)菌株與Δvel,Δvel2和△vel3菌株分別在葡萄糖、甘油和乳糖培養(yǎng)基中,在持續(xù)光照和持續(xù)黑暗的條件下培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)velvet家族參與到菌落形態(tài)維持和次級代謝調(diào)節(jié)過程中：與出發(fā)菌株相比,無論是在光照還是在黑暗的條件下,velvet缺失菌株的菌絲分支增多�！鱲el2的菌落直徑變小同時菌落邊緣不規(guī)則�！鱲el2不再生產(chǎn)黃色色素而△vel3產(chǎn)生更多的黃色素�！鱲e1和△vel3菌株生物量沒有發(fā)生大的變化,然而,△vel2的生物量明顯減少。敲除ve1和vel2后,在光照和黑暗條件下都檢測不到無性孢子生成；敲除vel3之后,無性孢子的生成量減少,說明ve1和vel2在孢子生成過程中起到關(guān)鍵作用,vel3起到輔助作用。同時檢測孢子生成相關(guān)基因wetA和abaA的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn),在velvet缺失菌株中,兩者都是下調(diào)的,說明velvet家族是通過調(diào)節(jié)孢子生成途徑的關(guān)鍵基因來調(diào)節(jié)里氏木霉孢子生成過程的。在光照和黑暗條件下,三種velvet缺失菌株纖維素酶的轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生了大幅度的下調(diào),尤其是在△ve1和△vel2菌株中。濾紙酶活、CMC酶活、pHVC酶活和pNPG酶活的測定,驗證了velvet家族蛋白參與到纖維素酶的調(diào)控過程中,而且ve1和vel2起到關(guān)鍵作用,vel3起到輔助作用。研究發(fā)現(xiàn),velvet調(diào)控纖維素酶表達(dá)是通過調(diào)控纖維素酶轉(zhuǎn)錄激活因子xyr1的轉(zhuǎn)錄水平。同時velvet調(diào)控纖維素酶表達(dá)不受到光調(diào)控纖維素酶途徑關(guān)鍵基因env的調(diào)控,同時也與纖維素酶轉(zhuǎn)錄因子clr-2無關(guān),暗示著可能還有新的途徑調(diào)控纖維素酶的表達(dá)。通過檢測UPR響應(yīng)途徑的基因轉(zhuǎn)錄發(fā)現(xiàn),velvet家族蛋白不參與纖維素酶的分泌過程。velvet家族作為新型轉(zhuǎn)錄因子,作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。文獻(xiàn)報道發(fā)現(xiàn),velvet結(jié)構(gòu)域能夠與brlA等結(jié)合,從而調(diào)控下游基因的功能。對于velvet家族蛋白如何調(diào)控纖維素酶表達(dá),下一步實驗考慮可以利用EMSA實驗來驗證velvet家族蛋白與纖維素酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子xyr1和cre1是否結(jié)合,從而直接驗證velvet家族是通過調(diào)控纖維素酶轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控纖維素酶的表達(dá)。同時,研究發(fā)現(xiàn),Vel能夠被磷酸化,下一步實驗可對磷酸化機(jī)制以及磷酸化作用進(jìn)行詳細(xì)的研究。2)里氏木霉碳源代謝阻遏因子Cre1研究。纖維素酶轉(zhuǎn)錄因子在纖維素酶的生產(chǎn)過程中起到非常重要的作用。轉(zhuǎn)錄因子分為轉(zhuǎn)錄激活因子和轉(zhuǎn)錄抑制因子。里氏木霉碳源代謝阻遏因子Cre1是主要的纖維素酶轉(zhuǎn)錄抑制因子,同時研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄激活因子xyr1的完全表達(dá)需要Cre1的存在。完全缺失cre1基因,菌體的生長會受到嚴(yán)重的抑制,導(dǎo)致菌體生長周期明顯變長,因此對于降低纖維素酶生產(chǎn)成本沒有太好的效果。根據(jù)文獻(xiàn)報道,里氏木霉Cre1是受到磷酸化調(diào)控的。因此本實驗對于Cre1的磷酸化對纖維素酶表達(dá)影響等方面進(jìn)行了研究。首先本實驗中利用酵母雙雜交實驗,我們證明了里氏木霉Cre1與酪蛋白激酶(CK)Ⅱ的催化亞基α1具有相互作用,與另外的一個催化亞基α2沒有相互作用。據(jù)文獻(xiàn)報道,CKⅡ在Cre1上磷酸化保守序列是HSNDEDD,其中S241位是磷酸化位點,同時S的磷酸化需要處于酸性環(huán)境中。為了研究該序列的變異對于纖維素酶生產(chǎn)的影響,我們利用定點突變的技術(shù),成功獲得了7個突變菌株:S241V (S), D243V (D), E244V (E), D243V/E244V (DE), S241V/D243V (SD), S241V/E244V (SE), S241V/D243V/E244V (SDE)。7株突變轉(zhuǎn)化子的生物量都沒有發(fā)生明顯的變化。將出發(fā)菌株與7個突變轉(zhuǎn)化子分別利用轉(zhuǎn)接的方法接種到葡萄糖、乳糖和纖維二糖培養(yǎng)基中檢測纖維素酶轉(zhuǎn)錄水平的變化。與出發(fā)菌株相比,在三種碳源培養(yǎng)條件下,S菌株纖維素酶轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生了明顯的下調(diào),原因可能是由于S241突變,導(dǎo)致不依賴磷酸化的永久性結(jié)合DNA,導(dǎo)致持續(xù)的碳源代謝阻遏。D, SD,SDE位點突變會導(dǎo)致在葡萄糖培養(yǎng)條件下,纖維素酶的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生大約10倍的上調(diào),在乳糖和纖維二糖培養(yǎng)基中基本沒有變化。E位點單獨不調(diào)控纖維素酶的變化,但是能夠影響S和D位點對于纖維素酶的影響,原因是纖維素酶的轉(zhuǎn)錄水平變化從大到小為EDED,同時SESDESDO具體的調(diào)控機(jī)制深入研究。突變轉(zhuǎn)化子在葡萄糖培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)錄水平提高高于乳糖和纖維二糖。由于Cre1發(fā)生磷酸化是在碳源代謝阻遏的條件下,我們研究了在葡萄糖條件下與Cre1具有相互作用的蛋白質(zhì),利用免疫共沉淀(Co-IP)的方法,成功獲得在該條件下與Cre1可能具有相互作用的蛋白2個蛋白,還有待于進(jìn)一步進(jìn)行驗證。對Cre1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn),Cre1蛋白在N端含有兩個Zn2Cys6鋅指結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),Cre1蛋白含有少量的α螺旋和p折疊,含有大量的無規(guī)則卷曲,同時發(fā)現(xiàn)Crel含有大概80%的親水氨基酸,說明Cre1具有很強(qiáng)的親水性。但是現(xiàn)在Cre1的結(jié)構(gòu)尚未被解析。為了對Cre1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,我們利用pGEX-4T-1將Cre1成功的進(jìn)行異源表達(dá),進(jìn)行結(jié)晶結(jié)構(gòu)分析。同時,為了研究磷酸化狀態(tài)Cre1的結(jié)構(gòu),我們獲得了Cre1后添加HⅠS標(biāo)簽的菌株,在葡萄糖條件下培養(yǎng),純化磷酸化Crel,很遺憾的是沒有拿到正確的Cre1蛋白。3)利用纖維素酶降解馬鈴薯渣生產(chǎn)葡萄糖實驗。本實驗中馬鈴薯渣是工業(yè)上抽取馬鈴薯淀粉之后的殘渣。試驗中馬鈴薯渣的底物濃度為25%。成分分析發(fā)現(xiàn)馬鈴薯渣中主要成分為淀粉、果膠和纖維素,不含有半纖維素,木素的含量很低。由于草酸青霉JUA10-1的酶液具有較高的纖維素酶比酶活和果膠酶酶活,里氏木霉TX具有較高的p-葡萄糖苷酶酶活。由于馬鈴薯渣中有較高含量的果膠,是纖維素酶降解纖維素的主要阻礙,因此本實驗中還添加了商業(yè)的果膠酶。在本實驗中利用草酸青霉JUA10-1酶液和里氏木霉TX酶液與果膠酶酶液進(jìn)行復(fù)配降解馬鈴薯渣里氏木霉降解高溫處理馬鈴薯渣的效果好于降解未處理的馬鈴薯渣；草酸青霉A10-1降解高溫處理和未處理馬鈴薯渣的效果相差不多,與里氏木霉TX降解高溫處理馬鈴薯渣效果基本一致。在復(fù)配實驗過程中,分別采用2000PGU/g干物質(zhì)果膠酶添加不同F(xiàn)PU/g干物質(zhì)里氏木霉TX或者草酸青霉A10-1酶液；8FPU/g干物質(zhì)里氏木霉TX酶液或者草酸青霉A10-1酶液添加不同PGU/g干物質(zhì)果膠酶,達(dá)到最高葡萄糖轉(zhuǎn)化率的復(fù)配方法是8FPU/g干物質(zhì)草酸青霉A10-1酶液添加1000PGU/g干物質(zhì)果膠酶酶液,葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為80%,葡萄糖的濃度為83.4mg/ml,葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸的轉(zhuǎn)化率為94.9%,葡萄糖酸濃度為81.4mg/ml,葡萄糖酸的生產(chǎn)速率為4.07g/L/h。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55;Q78
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2264618
