【摘要】：肝臟的發(fā)生和發(fā)育是一個受到精密調(diào)控的復(fù)雜過程。人們利用模式生物的研究已經(jīng)逐漸了解了肝臟細(xì)胞的起源、形態(tài)發(fā)生及生長發(fā)育過程,也鑒定出了一些參與肝臟發(fā)育的重要因子。作為一種研究胚胎早期發(fā)育理想的模式生物,斑馬魚受到了越來越多研究人員的關(guān)注,尤其是結(jié)合目前迅速發(fā)展的CRISPR-Cas9等技術(shù),使得相關(guān)的研究手段更加多樣、層次更加深入。本課題綜合利用遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究方法,以斑馬魚為模式生物,系統(tǒng)研究了bms1l基因在斑馬魚早期胚胎發(fā)育過程中的作用。通過ENU化學(xué)誘變篩選小肝臟表型的斑馬魚,我們課題組獲得了一個bmsll基因突變的斑馬魚品系bmsll~(sq163)。研究顯示在bmsll~(sq163)突變體中,bmsll基因第5外顯子發(fā)生了T到A的堿基突變,從而導(dǎo)致bmsll第154位密碼子從亮氨酸(CTG)置換為谷氨酰胺密碼(CAG)。相關(guān)表型分析發(fā)現(xiàn)bmsllsql63突變體中,包括肝臟、外分泌胰腺和腸道在內(nèi)的消化器官生長發(fā)育受到特異性的阻滯。進一步研究顯示,肝臟在早期起始和分化階段并沒有受到影響。為了深入驗證bmsll在肝臟發(fā)育過程中的重要作用,我們利用CRISPR-Cas9技術(shù)對bmsll基因進行敲除,從而獲得了另一個品系的突變體bms1lzjul。在該突變體中,bmsll基因第2個外顯子上有13個堿基的插入,從而破壞了蛋白的正常編碼。由于Bmsll蛋白的完全缺失,bmsllzju1突變體有著更為嚴(yán)重的消化器官生長發(fā)育缺陷。我們在bmsll~(sq163)和bmsllzju1兩個等位基因突變體的基礎(chǔ)上深入研究了Bmsll在斑馬魚肝臟發(fā)育過程中的功能。前人在酵母的研究中發(fā)現(xiàn)Bmsl是一個核仁蛋白并且能與Rcl1蛋白形成復(fù)合物,共同參與核糖體前體RNA(pre-rRNA)的加工剪切。因此,Bmsl對18S rRNA的成熟及核糖體生成有重要作用。根據(jù)以上研究,我們想了解斑馬魚中的同源基因bmsll是否有這些保守的功能。首先,通過免疫熒光共定位及免疫共沉淀實驗,我們發(fā)現(xiàn)Bmsll和Rcl1都是核仁蛋白并且能夠互作,同時也用人的這兩個蛋白進一步驗證了該功能的保守性。其次,我們發(fā)現(xiàn)bmsll~(sq163)和bmsllzjul突變體中pre-rRNA的加工過程和18S rRNA的生成均受到了影響,說明Bmsll確實在其中行使重要功能。另外,突變體肝臟細(xì)胞的核仁由于受到異常的pre-rRNA轉(zhuǎn)錄和加工影響,其形態(tài)也發(fā)生了明顯的改變。在上述研究過程中,我們發(fā)現(xiàn)bmsll突變體核仁中rDNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著上升,這使得與轉(zhuǎn)錄方向相反的DNA復(fù)制叉受到嚴(yán)重阻滯,進而引起了DNA損傷反應(yīng)。我們詳細(xì)研究了其中的P53信號通路,結(jié)果顯示在bmsll突變體中,P53及其異構(gòu)體的表達水平顯著提高,并且受P53調(diào)控的下游基因表達也被激活。由于P53的活化能夠抑制細(xì)胞周期的進行,我們在P53突變的背景下分析了bmsll~(sq163)突變體中消化器官的拯救情況。結(jié)果顯示該雙重突變體能夠部分拯救小肝臟和小胰腺的表型。接著,我們詳細(xì)分析了bmsll~(sq163)突變體的肝臟細(xì)胞在細(xì)胞周期中具體受阻滯的時期。結(jié)合細(xì)胞周期標(biāo)志蛋白免疫熒光和Edu摻入實驗,我們發(fā)現(xiàn)突變體中處于S期DNA復(fù)制階段的肝臟細(xì)胞比例顯著上升,相應(yīng)地,G2期至M期的比例顯著下調(diào)。通過Edu和Brdu不同時間點的雙標(biāo)實驗,我們進一步驗證了bmsll突變體的肝臟細(xì)胞中存在旺盛的DNA復(fù)制現(xiàn)象,從而使得肝臟中非整倍體和多倍體細(xì)胞的比例上升。綜合上述在bmsll~(sq163)和bmsllzju1突變體中的研究,我們不僅驗證了Bmsll是一個功能保守的蛋白,也發(fā)現(xiàn)了Bmsll在斑馬魚肝臟發(fā)育過程中有重要作用。此外,關(guān)于細(xì)胞周期和rDNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制的研究也讓我們更系統(tǒng)、全面地了解突變體中發(fā)生的關(guān)鍵事件,為我們下一階段更深入探索Bmsll的功能和作用機制打下了堅實的基礎(chǔ)。
[Abstract]:The genesis and development of the liver is a complex process regulated precisely. The origin, morphogenesis and development of liver cells have been gradually understood by using model organisms. Some important factors involved in liver development have also been identified. With the rapid development of CRISPR-Cas9 and other technologies, more and more researchers have paid close attention to it, which makes the related research methods more diversified and deeper. The role of ms1l gene in the early embryonic development of zebrafish was studied. A zebrafish strain bmsll ~ (sq163) with bmsll ~ (sq163) gene mutation was obtained by ENU chemical mutation screening of zebrafish with small hepatic phenotype. The results showed that mutation of the base T to A occurred in exon 5 of bmsll ~ (sq163) mutant, which led to the mutation of bmsll ~ (sq163) gene. The 154th codon of bmsll was replaced by glutamine code (CAG) from leucine (CTG). Phenotypic analysis revealed that the growth and development of digestive organs, including liver, exocrine pancreas and intestine, were specifically blocked in bmsllsql63 mutants. Further studies showed that the liver was not affected in the early initiation and differentiation stages. In order to further verify the important role of bmsll in liver development, we used CRISPR-Cas9 to knock out the bmsll gene and obtained another mutant bms1lzjul. In this mutant, there were 13 bases inserted into the second exon of the bmsll gene, which destroyed the normal coding of the protein. Bmsllzju1 mutant was found to be a nucleolar protein and to be capable of producing Rcl1 eggs. Bmsl plays an important role in the maturation and ribosome formation of 18S rRNA. Based on the above studies, we want to know whether the homologous gene bmsll in zebrafish has these conservative functions. First, through immunofluorescence co-localization and immunoprecipitation experiments, I We found that Bmsll and Rcl1 were both nucleolar proteins and could interact with each other, and the conservativeness of the function was further verified by human proteins. Secondly, we found that the processing of pre-rRNA and the production of 18S rRNA in bmsll ~ (sq163) and bmsllzjul mutants were affected, suggesting that Bmsll did play an important role. In addition, the morphology of the nucleolus of the mutant hepatocytes was significantly altered by abnormal pre-rRNA transcription and processing. During the above studies, we found that the transcriptional level of rDNA in the nucleolus of the bmsll mutant increased significantly, which resulted in severe blockade of the DNA replication fork opposite to the transcriptional direction and consequently caused DNA damage. We studied the P53 signaling pathway in detail. The results showed that the expression of P53 and its isomers was significantly increased in bmsll mutants, and the downstream gene expression regulated by P53 was also activated. The results showed that the double mutant could partially rescue the phenotype of small liver and small pancreas. Then, we analyzed the specific phase of cell cycle arrest in bmsll ~ (sq163) mutant hepatocytes. The proportion of hepatocytes in S-phase DNA replication phase increased significantly, and the proportion of G2 to M-phase decreased significantly. By double-labeling experiments at different time points in Edu and Brdu, we further verified that there was exuberant DNA replication in the hepatocytes of bmsll mutants, which resulted in aneuploidy and polyploid cells in the liver. Based on the above studies in bmsll ~ (sq163) and bmsllzju1 mutants, we not only verified that Bmsll is a functional conserved protein, but also found that Bmsll plays an important role in zebrafish liver development. In addition, the study on cell cycle and rDNA transcription, replication also allows us to understand the mutation more systematically and comprehensively. The key events in Bmsll lay a solid foundation for us to explore the function and mechanism of Bmsll in the next stage.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q954.4

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本文編號：2247181