【摘要】：間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有多分化潛能、強(qiáng)大的旁分泌作用和低免疫原性等優(yōu)點。動物試驗研究顯示,MSCs對多種組織損傷具有修復(fù)作用,表現(xiàn)出治療多種重大疾病的應(yīng)用前景,目前全球有多個MSCs治療心肌梗塞和腦中風(fēng)的臨床試驗在進(jìn)行。對于MSCs的移植,靜脈注射具有安全性高和容易操作等優(yōu)點,是目前干細(xì)胞移植最常用的途徑;但研究表明,體外培養(yǎng)的MSCs在靜脈注射后到達(dá)靶器官的數(shù)量極少,絕大多數(shù)細(xì)胞不能通過肺循環(huán)而滯留在肺臟中,并很快死亡,嚴(yán)重影響其對靶器官的修復(fù)效果。然而造成MSCs肺滯留的原因和機(jī)制并不清楚。對MSCs肺滯留分子機(jī)制的研究將有助于研發(fā)減少MSCs肺阻塞提高其到達(dá)損傷器官數(shù)量的方法,對MSCs應(yīng)用于臨床治療具有重大意義。在本論文中,流式細(xì)胞儀和蛋白質(zhì)免疫印跡分析顯示經(jīng)體外連續(xù)貼壁培養(yǎng)的MSCs表面的很多整合素如integrinβ1,α5和αVβ3的表達(dá)水平都顯著升高,而免疫熒光染色和流式細(xì)胞儀分析整合素的配體纖維粘連蛋白和玻連蛋白均在正常小鼠肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面表達(dá)。使用功能性阻斷抗體阻斷MSCs表面的integrinβ1,α5和αVβ3,使MSCs在靜脈注射后在小鼠肺臟中的滯留量顯著降低,多種檢測方法如熒光定量PCR和組織學(xué)分析均驗證了此結(jié)果;MSCs肺滯留量顯著降低的同時伴隨著在血液循環(huán)中的水平增加,并有更多的MSCs遷徙到小鼠心肌梗塞的心臟和耳朵發(fā)炎區(qū)域。本論文研究還發(fā)現(xiàn),將連續(xù)傳代并貼壁培養(yǎng)的MSCs經(jīng)過短時間的三維立體培養(yǎng),很多整合素的表達(dá)水平顯著下降,靜脈注射后在肺臟中的滯留量大幅度降低。我們的研究結(jié)果表明,整合素的過多表達(dá)和活化是MSCs肺滯留的一個重要因素。綜上所述,本研究證明了傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)的MSCs表面整合素過多表達(dá)和活化,產(chǎn)生過度的粘附能力,導(dǎo)致其靜脈注射后粘附在肺血管壁上。使用特異性功能阻斷抗體阻斷整合素的功能或者將MSCs經(jīng)過三維立體培養(yǎng)降低整合素的表達(dá)可以大幅度降低MSCs在肺中的滯留量,并增加MSCs在血液循環(huán)和到達(dá)缺血心肌和炎癥組織的數(shù)量。因此本研究提示,通過降低MSCs表面整合素的功能是降低其肺阻塞,增加其損傷組織到達(dá)量的有效方法,對MSCs臨床治療具有重大的科學(xué)意義。
[Abstract]:Mesenchymal stem cells (mesenchymal stem) have the advantages of multiple differentiation potential, strong paracrine effect and low immunogenicity. Animal studies have shown that MSCs can repair many kinds of tissue injury and show the prospect of application in the treatment of many major diseases. At present, there are many clinical trials on the treatment of myocardial infarction and cerebral apoplexy in the world. For the transplantation of MSCs, intravenous injection has the advantages of high safety and easy to operate, so it is the most commonly used way of stem cell transplantation at present. Most cells could not be trapped in the lung through pulmonary circulation and died quickly, which seriously affected the repair effect of target organs. However, the causes and mechanisms of pulmonary retention in MSCs are unclear. The study of the molecular mechanism of MSCs lung retention will be helpful to develop a method to reduce pulmonary obstruction of MSCs and increase the number of the injured organs. It is of great significance for the application of MSCs in clinical treatment. In this study, flow cytometry and Western blot analysis showed that the expression of many integrins such as integrin 尾 _ 1, 偽 _ 5 and 偽 V 尾 _ 3 on the surface of MSCs cultured continuously in vitro was significantly increased. Immunofluorescence staining and flow cytometry were used to analyze the expression of integrin ligand fibronectin and Glasectin on the surface of normal mouse pulmonary vascular endothelial cells. Using functional blocking antibody to block integrin 尾 1, 偽 5 and 偽 V 尾 3 on the surface of MSCs significantly reduced the retention of MSCs in the lungs of mice after intravenous injection. Many methods, such as fluorescence quantitative PCR and histological analysis, confirmed that the pulmonary retention of PCR was significantly decreased with the increase of blood circulation. And more MSCs migrated to the heart and ear inflammation areas of myocardial infarction in mice. It was also found that the expression level of many integrins and the retention of many integrins in the lungs were significantly decreased after a short period of three-dimensional culture of MSCs cultured with continuous passage and adherent culture. Our results suggest that overexpression and activation of integrin is an important factor in pulmonary retention in MSCs. In conclusion, this study demonstrated that the traditional adherent culture of MSCs surface integrin overexpression and activation, resulting in excessive adhesion, resulting in intravenous adhesion to the pulmonary vascular wall. Blocking the function of integrin by specific function or reducing the expression of integrin by three-dimensional culture of MSCs could significantly reduce the retention of MSCs in the lung. It also increases the number of MSCs in blood circulation and reaching ischemic myocardium and inflammatory tissue. Therefore, this study suggests that reducing the function of MSCs surface integrin is an effective method to reduce pulmonary obstruction and increase the arrival of injured tissue, which is of great scientific significance for the clinical treatment of MSCs.
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2

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本文編號：2191109